miRNA激活p21WAF1/CIP1基因表达及其对膀胱癌细胞的抑制作用

摘要

第一部分miRNAs激活膀胱癌细胞p21WAF1/CIP1基因表达及其机制
　　目的：筛选能和抑癌基因p21WAF1/CIP1（p21）启动子区域序列互补且评分较高的miRNAs，观察miRNAs表达水平与临床膀胱癌发生的相关性，检测其对膀胱癌细胞系T24和EJ细胞p21是否有激活效应，并初步探索其激活机制。
　　方法：采用miRanda算法检索p21基因启动子区域和miRBase数据库里所有人miRNAs进行互补配对，寻找评分较高的miRNA；应用实时荧光定量PCR检测10对临床膀胱癌组织和正常膀胱粘膜中这些miRNA和p21基因mRNA的表达水平；生物合成 dsControl，dsP21-322，miR-103b mimic，miR-370-5p mimic（miR-370 mimic），miR-1180-5p mimic（miR-1180 mimic）和miR-1236-3p mimic（miR-1236 mimic）（其中dsControl为阴性对照，dsP21-322为阳性对照），通过脂质体转染（终浓度为50 nM），在膀胱癌细胞系T24和EJ细胞中过表达这些dsRNAs和miRNAs，72小时后采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测p21 mRNA和蛋白表达水平；通过免疫荧光染色观察p21蛋白亚细胞表达位置；采用亚细胞蛋白提取试剂盒抽提T24和EJ细胞蛋白，Western blot进一步检测p21蛋白在胞浆和胞核表达水平。另外，合成3’或5’端标记生物素的 miRNAs以及反义链3’或5’端标记生物素的dsControl，进而转染到T24和EJ细胞内，72小时后采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP）检测生物素标记的dsRNA和miRNAs是否与p21启动子相结合。
　　结果：通过miRanda算法检索出miR-103b，miR-370，miR-1180和miR-1236分别与p21启动子区域-907/-887，-552/-537，-397/-379以及-243/-226互补匹配评分较高。实时荧光定量PCR提示相比正常膀胱粘膜细胞，miR-103b在膀胱癌中呈高表达，但差异无显著统计学意义（P>0.05）；miR-370，miR-1180以及miR-1236在膀胱癌中低表达，与正常膀胱粘膜细胞相比，差异均具有显著统计学意义（P<0.05）。p21 mRNA在膀胱癌中也呈低表达，和正常膀胱粘膜细胞相比，其差异有显著统计学意义（P<0.05）；行Pearson相关分析，miR-370，miR-1180和miR-1236表达和p21 mRNA表达呈正相关，有显著统计学意义；miR-103b表达与p21 mRNA表达呈负相关，无显著统计学意义。转染T24和EJ细胞72小时后，实时荧光定量 PCR和Western blot显示与 Mock和dsControl相比，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236能显著诱导p21 mRNA和蛋白表达，miR-103b未能诱导p21高表达。免疫荧光提示dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236主要诱导T24和EJ细胞核p21高表达，亚细胞蛋白Western blot检测进一步证实此现象。ChIP实验证实转染72小时后 miR-370，miR-1180和miR-1236主要通过与p21基因启动子区域结合，从而激活p21表达。
　　结论：miR-370，miR-1180和miR-1236在人膀胱癌呈低表达，与p21 mRNA表达水平呈正相关；miR-370，miR-1180和miR-1236能通过与p21基因启动子直接结合而激活T24和EJ细胞的p21表达，并且主要激活胞核内p21表达。
　　第二部分miRNA通过激活p21基因表达对膀胱癌细胞的抑制作用
　　目的：探讨miR-370，miR-1180和miR-1236对膀胱癌T24和EJ细胞的增殖，周期，凋亡，衰老，集落形成，迁移和侵袭的影响。
　　方法：脂质体转染dsControl，dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic到膀胱癌T24和EJ细胞。在转染后72小时提取细胞总RNA，逆转录，利用普通PCR扩增细胞周期调节蛋白（Cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4和CDK6）的cDNA，琼脂糖凝胶电泳检测Cyclin D1，CDK4和CDK6 mRNA的表达水平；流式细胞术检测T24和EJ细胞周期分布和凋亡情况；β-半乳糖苷酶染色观察T24和EJ细胞衰老情况；结晶紫染色观察转染后10天细胞集落形成情况；CellTiter96○R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）检测转染后24小时，48小时，72小时，96小时和120小时等5个时间点细胞增殖情况；Transwell法检测膀胱肿瘤细胞迁移和侵袭能力；共转染特异性抑制p21的干扰RNA（siP21）和miR-1236，琼脂糖凝胶电泳检测p21 mRNA表达水平；并观察共转染siP21和miR-1236对细胞周期、集落形成和细胞增殖的影响。
　　结果：在膀胱癌T24和EJ细胞中，与空白对照Mock和阴性对照dsControl转染组相比，转染dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic后72小时能显著抑制CDK4，CDK6和Cyclin D1 mRNA的表达，诱导细胞周期循环G0/G1期停滞；进一步统计分析显示，相比Mock和dsControl组，两种细胞转染dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic后细胞G0/G1期比例升高，其差异有显著统计学意义（P<0.05）；转染72小时，dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic转染组处于早期和晚期凋亡的细胞数明显多于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；并且可以显著的诱导 T24和EJ细胞衰老；克隆增值实验表明，相比 Mock和dsControl组，dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic转染组细胞集落形成数量明显减少，集落面积显著变小，集落形成率显著降低，差异有显著统计学意义（P<0.05）；MTS检测提示在转染后第4天（96小时），较Mock和dsControl转染组，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236能显著抑制膀胱癌T24和EJ细胞增殖（P<0.05）；Transwell实验证实，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236较Mock和dsControl能显著抑制T24和EJ细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）；因在3个miRNA中，miR-1236在膀胱癌组织标本中表达水平最低的，故采用 miR-1236进行如下实验。在 T24和EJ细胞分别共转染miR-1236 mimic和siP21后能显著抑制miR-1236诱导的p21 mRNA高表达；并且，siP21可有效消除miR-1236对细胞周期循环、集落形成和细胞增殖的抑制作用。
　　结论：dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic转染膀胱癌T24和EJ细胞可抑制Cyclin D1，CDK4和CDK6的表达，诱导肿瘤细胞周期循环停滞于 G0/G1期，促进细胞凋亡和衰老，抑制肿瘤细胞集落形成和增殖。此外，miR-1236主要通过激活抑癌基因 p21的表达而诱导膀胱癌细胞周期循环G0/G1期停滞，抑制细胞集落形成和增殖能力。

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第一部分miRNAs激活膀胱癌细胞p21WAF1/CIP1基因表达及其机制

前言

材料和方法

结果

讨论

[参考文献]

第二部分miRNAs激活p21基因表达对膀胱癌细胞的抑制作用

前言

材料和方法

结果

讨论

[参考文献]

综述: RNA激活在肿瘤中的研究进展

附录 攻读学位期间发表论文

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