NOD2协同TLR3介导LSEC活化HBV抗原特异性T细胞应答

摘要

目的:
　　1、探索天然免疫刺激剂NOD2-TLR3配体协同刺激能否打破肝窦内皮细胞(LSEC）免疫耐受状态。
　　2、研究LSEC在NOD2-TLR3介导的抗HBV免疫应答中的作用机制。
　　方法:
　　1、尾静脉高压水注射(hydrodynamic injection,HI) pAAV/HBV1.2质粒进入C57BL/6小鼠体内，建立慢性HBV复制小鼠模型。
　　2、HI方式将pSM2/HBV1.3质粒入C57BL/6小鼠体内，建立急性HBV复制小鼠模型，抗CD8免疫磁珠分离的方法分离脾细胞中CD8+T细胞。
　　3、抗CD-90.1磁珠免疫方法分离BALB/C小鼠nave T细胞。
　　4、胶原酶灌注和抗 CD146免疫磁珠分离的方法分离 C57BL/6小鼠的 na?ve LSEC。
　　5、流式细胞术检测 NOD2、TLR3配体单独或联合刺激 LSEC诱导的 BALB/C小鼠nave T细胞及急性HBV复制小鼠CD8+T细胞的增殖及细胞因子(IL-2、IFN-γ）的分泌。
　　6、NOD2、TLR3配体单独或联合刺激 LSEC20h后，加入HBsAg、HBcAg肽刺激20h，PBS洗涤抗原，再加入HBV抗原特异性T细胞共孵育，5天后收集T细胞，将T细胞用HI方式导入小鼠肝内，HI后第1、4、10、20、30、40、50天采血，分离血清，定量ECLIA检测血清中HBsAg、HBeAg，定量Real time-PCR检测血清中HBV DNA。
　　7、用 NOD2、TLR3配体单独或联合刺激 LSEC1h、6h、20h，1h后收集细胞Phosflow检测 NF-kBp65、MAPKp38磷酸化水平；6小时后，收集 LSEC，抽提总 mRNA，Real time RT-PCR方法检测 LSEC内 IL-6、IL-2、TNF-α、IL-10、TGF-β、IFN-β、IFN-γ、ISG15、CCL2、CCL3、CCL4、 CCL5、CCL7、CCL8、CXCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12 mRNA水平；20小时后，收集 LSEC及细胞上清，流式细胞术检测 LSEC表面分子：MHCⅡ、CD40、CD80、CD86、PD-L1、CD54、CD106。微量样本多指标流式蛋白定量检测(CBA(cytometric bead array））细胞上清中细胞因子(IL-6、TNF-α）。
　　8、用 Graphpad软件作图，SPSS18.0对数据进行统计学分析。
　　结果:
　　1、 NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC后并未诱导同种异型性 T增殖及分泌 IL-2、IFN-γ。
　　2、NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC后并未诱导HBV抗原特异性T细胞的增殖，但可增强HBV抗原特异性CD8+T细胞分泌IL-2及IFN-γ。
　　3、NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC介导小鼠体内抗HBV效应。
　　4、NOD2-TLR3配体协同刺激未明显增强LSEC内 NF-kB p56和 MAPK p38蛋白的磷酸化水平。
　　5、NOD2-TLR3配体协同刺激上调 LSEC内ISG15、IL-2、IL-6 mRNA表达水平及TNF-α、IL-6蛋白水平。
　　6、NOD2-TLR3配体协同刺激上调LSEC内趋化因子CCL5、CCL8、CXCL9、CXCL10 mRNA表达水平。
　　7、NOD2-TLR3配体协同刺激上调LSEC表面共刺激分子CD86表达水平。
　　结论:
　　1、NOD2-TLR3配体协同刺激LSEC后，可介导LSEC由免疫耐受状态转变为免疫激活状态。
　　2、LSEC在被 NOD2-TLR3联合激活后，虽不能诱导增强 HBV抗原特异性CD8+T细胞及同种异型性T细胞的增殖，但可增强HBV抗原特异性CD8+T细胞分泌细胞因子的能力。
　　3、NOD2-TLR3配体联合刺激LSEC可诱导HBV抗原特异性T细胞介导小鼠体内抗HBV效应。
　　本研究的创新点
　　1本次实验显示NOD2-TLR3配体协同刺激可打破LSEC的免疫耐受状态。
　　2初步阐明了NOD2-TLR3配体刺激激活LSEC的免疫状态的可能机制及LSEC介导的 HBV抗原特异性 T细胞应答情况。
　　本研究的意义:
　　NOD2-TLR3协同刺激可诱导肝内主要抗原提呈细胞LSEC由免疫抑制状态转为免疫激活状态，进一步通过处于激活状态的LSEC来诱导增强抗HBV病毒T细胞免疫应答，为探索NOD2-TLR3配体作为肝内免疫调节剂及抗HBV免疫治疗新策略的研究提供理论依据。

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中英文对照表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1材料：

2实验方法

实验结果

1 NOD2/TLR3配体协同刺激LSEC后未增强同种异型性T细胞应答

2 NOD2/TLR3配体刺激LSEC 诱导体外及体内HBV抗原特异性T胞应答

3 NOD2-TLR3配体协同刺激并未促进NF-kB p65和MAPK p38的磷酸化

4 NOD2-TLR3配体协同刺激上调LSEC细胞因子(ISG15、IL-6、IL-2）表达及TFN-α、IL-6的分泌

5 NOD2-TLR3配体协同刺激上调LSEC内趋化因子CCL5、CCL8、CXCL9、CXCL10的表达

6 NOD2-TLR3配体协同刺激上调小鼠LSECS共刺激分子CD86的表达

讨论

参考文献

综述:NOD2/TLR3与HBV感染研究进展

致谢