NOD1/NOD2介导的天然免疫应答对HBV持续复制的影响及其机制

摘要

目的：
　　1、探索 NOD1/NOD2介导的天然免疫应答对小鼠体内 HBV复制影响及其可能机制。
　　2、研究肝窦内皮细胞(LSEC)在 NOD1/NOD2受体介导的抗 HBV免疫应答中的作用和机制。
　　方法：
　　1、尾静脉高压水注射 pAAV/HBV1.2质粒建立慢性 HBV复制小鼠模型,并以尾静脉高压水注射方式把 NOD1/NOD2配体直接导入肝内。
　　2、按既定时间点采取小鼠血标本,并取肝组织及脾组织。用定量 ELISA检测血清 HBsAg和HBeAg,定量 real time-PCR检测血清中HBVDNA水平;ELISPOT检测脾细胞中特异性分泌 IFNγ细胞数;用免疫组织化学方法检测肝组织中HBcAg的表达。
　　3、用胶原酶灌注与抗-LSEC免疫磁珠分离方法分离 C57BL/6小鼠LSEC。
　　4、应用Real-time RT-PCR检测基础水平 LSEC中NOD1/NOD2的表达。
　　5、用C12-ieDAP、MDP、ssRNA40配体刺激 LSEC,6h,20h收集细胞及细胞上清,定量 RT-PCR检测:NOD1、NOD2、IL-6、RIP2、TNFα、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10、CCL-2、CCL-3、CCL-5;ELISA检测细胞上清中的细胞因子:IFNα/β/γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、, IL-18;流式细胞术检测细胞表面分子:PD-L1、CD40、CD86、MHCII、CD106、CD54、CD80。
　　6、Graphpad软件作图,SPSS18.0对数据进行统计分析。
　　结果：
　　1、NOD1配体 C12-ieDAP(20μg/只)高压水注射处理明显抑制了慢性 HBV复制小鼠血清中HBsAg、HBeAg及HBVDNA,肝组织中HBcAg表达也被抑制。而NOD2配体 MDP处理时未发现有抑制HBV复制效应,其余注射方法均未观察到体内的抗HBV效应。
　　2、NOD1配体 C12-ieDAP高压水注射处理后,脾脏中HBcAg特异的分泌 IFN-γ细胞数显著增加。
　　3、基础状态下 LSEC中NOD1呈高度表达,而NOD2表达水平相对较低。
　　4、NOD1配体 C12-ieDAP激活 LSEC诱导 NOD1、RIP2、IL-6、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-9、CCL-2和CCl-5等 mRNA水平上调;NOD2配体 MDP激活 LSEC诱导 RIP2和IL-6 mRNA水平上调;ssRNA40(可能通过 NOD2途径)刺激 LSEC诱导 RIP2、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10、CCL-2与 CCl-5等 mRNA水平上调。
　　5、NOD1与 NOD2配体刺激诱导 LSEC细胞因子的产生:C12-ieDAP10μg/ml刺激时有 IFN-γ效应分子产生;IL-6效应分子在不同配体不同浓度刺激下均有所产生,其中C12-ieDAP10μg/ml、MDP10μg/ml、ssRNA400.2μg/ml刺激下可产生高水平 IL-6。而其它细胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IFN-α和IFNβ)均未检测到。
　　6、LSEC受 C12-ieDAP(NOD1配体)刺激后 CD40、CD86和PD-L1上调,未发现 MHCII、CD106、CD54和CD80上调。且在5μg/ml浓度刺激下, CD40和CD86上调较明显;在2μg/ml浓度刺激下, PD-L1上调较明显。MDP(NOD2配体)刺激后 CD40、CD86和PD-L1上调,未发现 MHCII、CD106、CD54和CD80上调。且在5μg/ml浓度刺激下, CD40、CD86和PD-L1上调较明显。ssRNA40刺激后 PD-L1上调,未发现 CD40、CD86、MHCII、CD106、CD54和CD80上调。
　　结论：
　　1、在慢性 HBV复制小鼠模型中,NOD1激动剂在肝内具有抗 HBV效应,而NOD2激动剂或肝外途径运用NOD1激动剂均无抗 HBV效应。
　　2、NOD1和NOD2在 LSEC中功能性表达,均能被其配体激活,并介导 NF-κB信号途径活化产生 IL-6效应分子及一系列趋化因子;NOD1还介导产生 IFN-γ效应分子,而NOD2无此免疫应答效应。
　　3、NOD1介导的天然免疫应答对 HBV复制影响可能通过介导炎症反应,募集中性粒细胞,产生 IFN-γ以及调控 HBcAg特异性的获得性免疫应答发挥作用。
　　本研究的创新点：
　　1、发现 NOD1介导的天然免疫应答可以抑制对小鼠体内 HBV复制。
　　2、研究了LSEC中NOD1与 NOD2介导的信号途径及其天然免疫应答效应。
　　3、初步阐明了NOD1介导的抗 HBV效应及其可能机制。
　　本研究的意义：
　　1、揭示了LSEC中NOD1与 NOD2是肝脏内天然免疫的重要组成部分,与肝脏的炎症、感染性疾病的发病密切相关。
　　2、NOD1参与了肝内抗 HBV免疫应答,为探索 NOD1激动剂作为免疫调节剂和疫苗佐剂的应用前景以及为抗病毒免疫干预新策略的研究提供理论依据。

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前言

肝脏局部微环境与肝内PRR

肝内NOD－TLR信号转导网络

NOD1与NOD2介导信号途径

NOD1与NOD2介导抗病原微生物免疫应答

参考文献

第一部分 NOD1/NOD2介导的免疫应答对小鼠体内HBV复制的影响及其机制

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 肝窦内皮细胞NOD1/NOD2介导的天然免疫应答的信号通路研究

材料与方法

实验结果

讨 论

参考文献

综述一

1. NLRs家族

2 NLR抗病原微生物的作用及其机制

3 总结

参考文献

综述二

一、NOD1与NOD2受体分子结构

二、NOD1与NOD2介导信号途径

三、NOD1与NOD2介导抗病原微生物免疫应答

三、小结

参考文献

致谢