中国红豆杉中调控Taxol合成的TcWRKY转录因子的克隆及分析

摘要

紫杉醇是从红豆杉属植物中提取的一类具有独特抗癌功效的次级代谢产物，目前市场供需矛盾突出。植物细胞大规模培养生产紫杉醇是解决这一矛盾的有效方法之一，而转录调控机制的明晰有助于提高其产业化水平。转录因子是植物次生代谢产物合成中最为重要的调节因子之一。WRKY转录因子家族是植物特有的超基因家族，对植物的生长、发育、防御、代谢等生理活动具有重要作用。本文对中国红豆杉转录组数据库中的TcWRKY基因进行了筛选和克隆，并初步探究了TcWRKY转录因子在紫杉醇合成过程中的功能和机理。本研究主要取得了以下结果：
　　（1）中国红豆杉中TcWRKY转录因子的筛选与进化分析。本课题从中国红豆杉转录组数据库[1]中共筛选到61个TcWRKY基因。对61个TcWRKY转录因子进行进化和聚类分析发现，属于I类WRKY转录因子有16个，II类共44个，III类则只有1个。而44个II类TcWRKY转录因子又分属于IIa（8个）、IIb（10个）、IIc（14个）、IId（5个）和IIe（7个）5个亚类。
　　（2）TcWRKY转录因子响应激素诱导的表达特征分析。根据聚类分析和序列比对结果，分别在各亚类中选取1个TcWRKY转录因子进行进一步探究：TcWRKY8（IIc类）、TcWRKY20（III类）、TcWRKY26（I类）、TcWRKY41（IIe类）、TcWRKY44（IId类）、TcWRKY47（IIa类）和TcWRKY52（IIb类）。对其进行MJ和SA诱导后，发现TcWRKY44、TcWRKY47在MJ和SA诱导后均有明显上调；MJ对TcWRKY8、TcWRKY20、TcWRKY26、TcWRKY41都有显著上调作用，而SA对以上4个基因均有明显抑制；TcWRKY52对MJ没有明显响应且受到SA的显著抑制。
　　（3）TcWRKY基因超表达对紫杉醇合成相关基因的影响。选取显著响应于 MJ的TcWRKY8、TcWRKY20、TcWRKY26、TcWRKY44、TcWRKY47基因，分别在中国红豆杉细胞中超表达后，研究了其对紫杉醇合成相关酶基因DBAT和T5H，及紫杉醇合成调控因子基因TcERF12和TcERF15表达的影响。其中，TcWRKY44超表达明显抑制了以上4个基因的表达；TcWRKY20、TcWRKY26超表达能在不同程度上提高以上4个基因的表达水平；而 TcWRKY8、TcWRKY47超表达提高了DBAT、T5H、TcERF15的表达，抑制了TcERF12的表达。
　　（4）TcWRKY47转录因子与 DBAT启动子作用方式的探究。由于TcWRKY47能够明显响应MJ和SA，且对紫杉醇合成相关酶具有一定的正向调控作用，本课题研究了TcWRKY47转录因子与DBAT启动子在中国红豆杉细胞内的作用方式。通过突变DBAT启动子上的W-box后发现，当有WA-box的存在或只有WC-box存在时，TcWRKY47与DBAT启动子的结合较弱，当 WB-box存在且不存在WA-box时，TcWRKY47与DBAT启动子的结合作用有较明显提高。以上结果说明，TcWRKY47与DBAT启动子上的3个W-box具有不同的作用方式：与WA-box结合时，TcWRKY47发挥抑制作用；与WB-box结合时，发挥激活作用；而与WC-box的作用效果不明显。
　　综上，本研究从中国红豆杉TcWRKY转录因子中筛选得到对紫杉醇的合成具有一定调控作用的TcWRKY47转录因子，并探究了其与DBAT基因启动子的作用方式，为研究TcWRKY转录因子对紫杉醇合成的调控作用机理和高产细胞系的构建奠定了基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪论

1.1 红豆杉细胞中紫杉醇合成调控研究进展

1.2 转录因子调控植物次级代谢产物合成研究进展

1.3 WRKY转录因子及其对植物次生代谢产物合成的调控作用

1.4 本研究的主要内容和目的意义

2 中国红豆杉中TcWRKY转录因子的筛选和分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

3 TcWRKY转录因子的功能研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

4 TcWRKY47转录因子调控DBAT基因的作用机理

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 本文的主要创新点

5.3 展望

致谢

参考文献

附录I 攻读硕士学位期间发表文章

附录II 已克隆的TcWRKY序列

附录III 部分质粒酶切和载体构建的图片

附录IV qRT-PCR引物序列

附录V 主要缩略词