拜氏梭菌改良及丁醇发酵条件研究

摘要

近年来，随着化石燃料储备量的日益减少及其过度使用带来的环境污染日趋严峻，各国科研人员极力寻找可再生的清洁能源。丁醇具有燃烧值高、腐蚀性小、可与汽油任意比混合等优点，得到研究人员的广泛青睐，被认为是潜在的新型能源。发酵法生产丁醇因具有反应温和、选择性好、不需要添加催化剂等优点而倍受关注，但也面临着原料成本高、产物浓度低、分离纯化成本高等问题。本文以拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB8052）为出发菌株，通过利用II型内含子基因失活技术构建基因Cbei_2073敲除载体转化拜氏梭菌的方法，筛选出高产丁醇的菌株，并进行代谢调控研究；最后，利用廉价黄姜糖液代替葡萄糖发酵丁醇来降低成本，并通过对培养基和培养条件优化来提高丁醇产量。主要研究结果如下：
　　（1）对Clostridium beijerinckii NCIMB8052组氨酸激酶进行分类、筛选，并与已报道的丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum ATCC824）组氨酸激酶基因cac3319同源率比较，其中基因Cbei_2073与cac3319同源率最高，达到了48.54％，而其他组氨酸激酶同源率低于20%。根据II型内含子基因敲除的方法，利用大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体pMTL007C-E2成功构建基因Cbei_2073敲除载体，并电转化拜氏梭菌，筛选出一株红霉素抗性菌株cb2073。通过发酵对比野生型菌株，发现菌株cb2073发酵性能明显高于野生型菌株，丁醇和总溶剂（丁醇、丙酮和乙醇）产量分别为12.47±0.54 g/L和18.46±0.71 g/L，分别提高了17.3%和19.5%。
　　（2）为了进一步提高菌株cb2073的丁醇产量，研究了添加碳酸钙（pH缓冲剂）、L-半胱氨酸（还原剂）、丁酸钠（有机酸盐）、中性红（电子载体）和变温发酵五种调控方式对菌株丁醇产量的影响。结果如下：碳酸钙促进了有机酸的积累，对丁醇和总溶剂的合成有较强的抑制作用；L-半胱氨酸在低浓度时，对丁醇和总溶剂的合成没有明显的促进作用，而随着L-半胱氨酸浓度的增加，菌株丁醇和总溶剂的合成抑制增强；丁酸钠在菌株生长对数期后期（16h）添加时有利于丁醇和总溶剂的合成，添加丁酸钠浓度达0.3%时效果最佳，丁醇和总溶剂产量相对于对照组分别提高了12.9%和8.9%；中性红对菌株生长和丁醇合成有抑制作用；变温发酵时，对数后期（18h）降低发酵温度继续发酵有利于丁醇和总溶剂的积累，降低至28℃进行发酵时丁醇和总溶剂产量最高，相比于对照组分别提高了15.5%和11.6%。
　　（3）利用黄姜糖液代替葡萄糖作为碳源发酵生产丁醇，发现黄姜糖液能够促进菌株cb2073丁醇和总溶剂的合成，相对于葡萄糖发酵分别提高了8.8%和15.4%。进一步通过单因素实验和响应面法优化黄姜糖液培养基和发酵条件，确定在P2培养基②缓冲液、③维生素和④矿物质成分不变的情况下，初始糖浓度为70.00 g/L，酵母粉浓度为0.55 g/L，初始pH6.0，转速150 rpm，34℃发酵至18 h，添加4.92 g/L的丁酸钠，同时将温度降至28℃发酵至84 h，丁醇产量最高。在此条件下，丁醇和总溶剂产量分别为14.94±0.13 g/L和23.53±0.62 g/L，相比优化前分别提高了17.08%和10.68%。
　　综上所述，本文通过对拜氏梭菌改良及丁醇发酵条件优化，降低了发酵原料成本，并且提高了丁醇产量，为丁醇发酵的工业生产提供了一定的理论依据。