N-型钙离子通道抑制剂ω-芋螺毒素的表达、纯化及活性研究

摘要

ω-芋螺毒素（Conopeptide，Conotoxin，CTX）是第一类被确定的特异性阻断电压门控钙离子通道（VGCC）的天然毒素。MⅦA作为一种ω-芋螺毒素，它能够特异性地阻断N-型电压门控的钙离子通道（NGCCs）。NGCCs在控制脊髓神经的疼痛传递中起着极其重要的作用，而MⅦA通过阻断该类离子通道Cav2.2达到镇痛效果，从而具有重要的临床意义。但是目前 MⅦA在治疗镇痛时有较大的副作用，包括：眩晕、眼球震颤、嗜睡、步态异常和运动失调等，严重影响了它的广泛应用。最近研究发现，MⅦA突变体ω-2具有与MⅦA同样的镇痛效果但副作用极小，因此大量合成ω-2毒素蛋白能极大推动ω-2应用到更多研究和医药领域。目前为止，绝大多数多肽毒素包括ω-2毒素，主要通过化学方法如固相多肽合成法获得，但是该化学合成法过程复杂、耗时较长且费用昂贵。为此，为了高效经济地获得大量ω-2毒素，本文拟在大肠杆菌表达系统中发展了一种新的ω-2毒素蛋白表达法，并通过此方法获得了具有较高纯度的ω-2毒素蛋白。
　　ω-2毒素蛋白仅含25个氨基酸残基，分子量较小，且ω-2富含二硫键，在大肠杆菌细胞质相对偏还原的环境中纯化表达非常困难。为了得到可溶性的ω-2融合蛋白，我们建立了MBP-ω-2和DsbC在OrigamiB（DE3）细胞质中的共表达体系。在该表达体系中引入DsbC，其目的是促进ω-2中二硫键的正确折叠，从而得到具有生物活性的ω-2毒素蛋白。通过该体系，我们成功获得了可溶性的、空间结构折叠良好且纯度较高的ω-2毒素蛋白。最后通过电生理实验，检测到ω-2对外源表达的Cav2.2有一定的阻断效果，从而确定其生理作用。
　　综上所述，本人硕士期间成功建立了在大肠杆菌表达体系中获得ω-芋螺毒素MⅦA突变体ω-2毒素蛋白的有效方法，该方法为高效经济地大量合成ω-2提供了保障，具有一定的经济和临床应用前景。同时，该项工作为其他类似多肽毒素的生物批量合成提供了借鉴，有效推动了生物多肽毒素在药物应用领域的研究。

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1 绪 论

1.1 生物毒素的分类及应用价值研究

1.2 芋螺毒素的种类、功能及应用价值

1.2.1 芋螺毒素的种类

1.2.2 芋螺毒素的功能及应用价值

1.3 芋螺毒素与N-VGCCs的相互作用及研究进展

1.4 本文研究的主要内容

2 实验材料和技术原理

2.1 实验材料

2.2 质粒构建

2.3 表达测试

2.4 ω-2的大量表达纯化

2.5 人胚胎肾细胞的培养

2.6 电生理实验

2.7 数据处理

3 实验结果

3.1 质粒构建分析

3.2 表达条件探索结果

3.3ω-2表达纯化结果

3.4 电生理活性检测

4 总结与展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间参与发表的论文

附录2 主要英文缩略词