新型双功能金属螯合剂及在PET成像中的应用

摘要

目的:
　　近年来，放射性药物的发展十分迅速，尤其是正电子发射成像（PET）诊断药物和放射免疫治疗药物。双功能金属螯合剂作为连接放射性金属核素与功能性配体的纽带，在放射药物的研究中发挥着重要的作用。64Cu和68Ga是科研和临床中两种常用的金属核素，目前已有多种双功能金属螯合剂可用于对二者的标记。然而这些螯合剂通常需要较为苛刻的标记条件，且对放射性金属的选择性低，放射比活度低等，严重限制了新型放射性药物的研究。功能性配体是研究放射药物的另一个重要的因素。受制于传统单价的/单靶向和单模态的分子探针的固有属性，很难应对肿瘤等疾病的复杂性和多样性。近年来，多价的和多模态的新型分子探针由于它们较高的受体亲和力和相互补充的成像能力等优点而备受关注。然而它们的制备过程常常涉及到繁杂的保护和脱保护、多次HPLC纯化和较低的产率等问题，严重的制约了这些分子探针的应用和发展。
　　针对这些问题，有必要设计并合成出一些具备标记条件温和，所得标记物稳定性高、放射比活度高等性质的双功能金属螯合剂，并以之为平台应用于放射性药物的研究中，这也是本研究的主要目的之一。本研究另一个主要的期望是设计并合成出一个基于双功能金属螯合剂结构的通用平台来简化多价的和多模态的分子探针的合成过程，从而促进这一领域的发展。
　　方法:
　　设计并合成三种基于 NE3TA结构的双功能螯合剂，并将其与多肽 LLP2A偶联并分别进行64Cu和68Ga标记，测试其放射比活度、血浆稳定性等性质。利用LC-MS研究p-NO2-PhPr-NE3TA对Cu2+螯合的选择性。测试被64Cu和68Ga标记的分子探针在B16F10细胞中的摄取及流出情况。建立荷B16F10肿瘤小鼠模型，并将被64Cu和68Ga标记的分子探针应用于该模型的肿瘤靶向PET/CT显像。
　　接着设计并合成具有两个不同偶联功能基团的双功能金属螯合剂 NOTA2tBu-N3，然后利用该平台将靶向uPAR的多肽AE105及靶向整合素αvβ3受体的c(RGDyk)偶联，从而制备具有不同长度PEG连接基团的多肽异源二聚体分子探针。将各异源二聚体分子探针进行64Cu标记后，通过细胞实验，筛选出一个性质较好的多肽异源二聚体分子探针，并应用于荷U87MG肿瘤小鼠的PET/CT成像。其结果与它相应的单聚体分子探针64Cu-AE105及64Cu-RGD的成像结果进行比较。另外，利用NOTA2tBu-N3为平台，通过点击化学或者固相合成的方法制备其他类型的分子探针，比如多肽同源二聚体和PET/光学多模态分子探针等。
　　结果:
　　即使在十倍量Fe(III)存在的情况下，p-NO2-PhPr-NE3TA依然能优先与Cu(II)进行螯合，显示出对Cu(II)较高的选择性。其多肽偶联物NE3TA-LLP2A可在室温下被64Cu标记，并具备良好的血浆稳定性，同时其放射性比活度值达3~4 mCi/nmol，远高于NOTA-LLP2A的~1 mCi/nmol。虽然所合成的另外两个双功能金属螯合剂与64Cu的标记结果不理想，但 p-SCN-PhPr-NE2P1A表现出优秀的68Ga标记属性。其偶联物NE2P1A-LLP2A可在室温、中性的pH下在15 min内完成68Ga标记，且具备较好的血浆稳定性；而在相同的条件下NOTA-LLP2A的68Ga标记率低。
　　64Cu-NE3TA-LLP2A和68Ga-NE2P1A-LLP2A在荷B16F10小鼠的生物分布结果类似，均在肿瘤部位有较高的摄取,且肿瘤/肌肉比值高。64Cu-NE3TA-LLP2A的肿瘤/肌肉比值在2 h，4 h和24 h分别达到5.81±0.99、10.50±2.02和25.19±7.78。68Ga-NE2P1A-LLP2A的肿瘤/肌肉的比值在1 h，2 h和4 h分别达到6.66±1.87、10.62±2.98和10.25±1.45。将二者用于同一肿瘤模型的PET/CT成像中时，在注射64Cu-NE3TA-LLP2A后的2 h，4 h和注射68Ga-NE2P1A-LLP2A后的1 h，2 h均能明显分辨出肿瘤。同时注射了阻断剂量的LLP2A的阻断组小鼠的生物分布及PET/CT成像均充分体现了B16F10肿瘤对LLP2A摄取的特异性。
　　利用 NOTA2tBu-N3平台，方便地合成出四个多肽异源二聚体分子探针AE105-PEGn-NOTA-PEG4-RGD（n=0，4，8，12，分别简写为T1，T2，T3，T4），一个多肽同源二聚体分子探针(AE105-NOTA-PEG4-AE105)及两个PET/光学双模态分子探针(AE105-NOTA-nonclick-Cy3和AE105-NOTA-click-Cy5)。所有分子探针均能与64Cu在放射比活度~1 mCi/nmol下进行标记，且标记后在人血浆中稳定性较好。细胞实验表明，随着PEG链的增长，各分子探针在U87MG细胞中的摄取率有逐渐增加的趋势，顺序为T4>T3>T2≥T1，而与U87MG细胞结合的稳定程度顺序为T3>T2≥T1>T4。在荷U87MG裸鼠模型的生物分布试验中，64Cu-T3在肿瘤组织中摄取比较高，其肿瘤/肌肉比值在1 h，4 h，24 h分别为4.37±1.46,12.69±3.08，和15.47±3.32。PET/CT成像实验结果显示，64Cu-T3在肿瘤中的摄取率显著高于64Cu-RGD和64Cu-AE105。64Cu-T3的肿瘤/肌肉比值显著高于64Cu-AE105，与64Cu-RGD接近。
　　结论及创新点:
　　设计并合成了多个新颖的双功能螯合剂，其中成功 p-SCN-PhPr-NE3TA表现出对Cu(II)较高的选择性，且与64Cu标记的条件温和，放射比活度高。所合成的p-SCN-PhPr-NE2P1A是一个很好的68Ga螯合剂，可以应用于温度和酸敏感的生物分子的68Ga标记。64Cu-NE3TA-LLP2A和68Ga-NE2P1A-LLP2A均对B16F10肿瘤具有出色的靶向性，在黑色素瘤的诊断中具有很好应用前景。
　　我们也成功的合成了一个基于双功能螯合剂结构的合成平台，可极大的简化多肽异源二聚体等分子探针制备过程。与其它平台比较，我们所合成的这个平台具有多重优势，包括简单的合成（无需大量的保护和脱保护及反应条件优化过程）、简单的纯化过程（需要更少的或只需一次色谱分离），更高的产率。更重要的是，这个平台还可以用于制备多肽同源二聚体、PET/光学双模态等分子探针，用途广泛。多肽异源二聚体分子探针64Cu-T3展示了比其单聚体分子探针更高的肿瘤摄取率以及更好的体内肿瘤成像效果。总而言之，这个平台提供了一条通用和可靠的方法用于制备多模式的分子探针，并且可以作为一个模块化的平台用于多模式分子探针的结构优化或者日常的临床前/临床研究。

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前言PET 成像简介

1.PET 成像及原理

2.常用PET核素

3．PET 分子探针类型

4. 基于配位化学的受体靶向性 PET 分子探针

5．总结

第一部分基于NE3TA结构的新型双功能螯合剂及在PET成像中的应用

引言

第一章 基于 NE3TA 结构的新型双功能螯合剂的设计与合成

第二章 多肽偶联物的的合成及体外放射性标记

第三章 分子探针在荷瘤小鼠中的体内分布及 PET 成像

第一部分总结

第二部分基于双功能螯合剂结构的双重靶向分子探针合成平台的设计、合成及应用

1．材料与试剂

2．实验方法

3．结果与分析

4．总结

全文总结

参考文献

综述：肿瘤靶向多肽 PET 分子探针的研究进展

致谢

附录