新型联合遗传标记SNP-STRs应用于不平衡混合斑的探索性研究

摘要

研究背景:在法医物证实际工作中，相当数量的生物检材来源并不是单一的，混合斑的存在，因其不确定的来源人数和各成分的混合比例，带给了物证工作较大的实验方法上和解释方面的困难。位于常染色体上的短串联重复序列（STR）因其广泛的分布性和良好的多态性，已成为所有现代法医物证实验室的常规检测目标。近二十年来，对于混合斑STR分型结果的解释方法经历了从单纯基于峰高、峰面积等似然比判断法，到更客观科学的统计学方法如贝叶斯理论的转变，但是不同解释方法标准不同，且西方法庭科学对有些解释过程存疑。此外，普通STR分型时，混合比例超过10：1的混合斑中次要成分的扩增会受到主要成分的面具效应（Mask effect），使得次要成分分型结果无法读取。另一方面，为了加大不同混合成分之间的可检测的区别，法医学发展应用了更多更灵敏的遗传标记，比如Y-STR、单核苷酸多态性位点（SNP）、插入缺失多态性（DIP）等，极大的提高了鉴别混合斑中次要成分的能力。但是DIP、SNP等由于其自身多态性的限制，只能作为补充检测，无法普遍应用。近几年，Castella V等人提出了一种联合遗传标记DIP-STR，其集合了STR良好的多态性和DIP的敏感性，仅用普通STR分型检测设备成功检测到1000：1混合斑中的次要成分。2013年，Wang L等人应用扩增阻滞突变系统（AMRS）原理成功实现用三条引物将SNP联合STR在一个聚合酶链式反应(PCR)中特异性扩增，因此，可以探索SNP-STR联合遗传标记在不平衡混合斑中的应用前景。为了实现效能的评估，需要建立一个SNP-STRs复合扩增体系，并检验其在不同比例混合斑中的实际鉴别能力。
　　目的:构建SNP-STRs复合扩增体系并探索SNP-STR联合遗传标记在不平衡混合斑中应用的可行性。
　　方法:
　　（1）查阅数据库和文献资料，按照以下标准，筛选靶目标：①STRs各位点之间连锁平衡，且STRs是已经报道过多态性较好的位点；②SNP位点位于常色体上STR位点上游或者下游200bp范围内；③SNPs位点在中国汉族人群中最小等位基因频率≥0.15；④各位点有效信息基因型概率I≥0.2225。
　　（2）根据AMRS原理，利用Primer3软件设计目标位点的引物，并测试每组引物特异性。
　　（3）构建复合扩增体系：①通过调整引物浓度或改变引物序列，排除或者降低复合扩增体系引物之间的相互影响；②调整峰高（2ng标准品，杂合子峰高1000-3000RFU，纯合子峰高3000-6000RFU）。
　　（4）复合扩增体系对于单源性DNA灵敏度检测。
　　（5）利用350个湖北汉族无关个体，调查复合扩增体系的群体数据。（6）用不同血源DNA，模拟案件最常见的双源性混合血斑，并设置不同浓度混合比，测试复合扩增体系检测混合斑次要成分的灵敏度。
　　结果:
　　（1）挑选出8个连锁平衡的SNP-STRs位点并加上性别基因组成一个复合扩增体系。
　　（2）所有位点在湖北汉族人群中均有较好遗传多态性，且每个位点统计结果均符合哈迪-温伯格平衡（Hardy－Weinberg equilibrium）。
　　（3）复合扩增体系对单源性DNA灵敏度可达0.05ng，对双源性混合斑可检测次要成分的混合比是20：1。
　　（4）部分位点的可检测比例高于20：1，最高可达1000：1。
　　结论:本文成功构建了新型联合遗传标记SNP-STRs复合扩增体系并肯定了其应用在不平衡混合斑的实际鉴别能力。

目录

声明

主要英文缩略词注解

前言

材料与方法

1.材料

2 方法

结果

1.目标SNP-STR的筛选结果

2.复合扩增体系建立以及引物调试结果

3.标准品的分型结果

4.复合扩增体系的灵敏度

5.复合扩增体系检测双来源的混合斑的灵敏度

6.统计学分析

7.案例分析

8.各个位点灵敏度探索

讨论

1. SNP-STRs在基因组分布的广泛性

2. SNP-STRs在湖北汉族人群的多态性分析

3. 构建复合扩增体系难点

4. SNP-STRs实际应用的可行性

5. SNP-STR与DIP-STR的比较

6. 复合扩增体系的优势和不足

小结

参考文献

综述:混合斑研究的最新进展

附录1

致谢