细胞捕获与四个遗传标记系统在混合精斑中个人识别的意义

摘要

在性犯罪案件中，受害人可能同时受到两个或两个以上男性的性侵害，在此类案件中获得的物证检材多为混合精斑。通常采用的常染色体STR分型技术难以对不同个体分别进行同一认定，Y染色体的STR分析结果可以与犯罪嫌疑人进行比对，但由于其特殊的遗传方式，只能用于排除，而无法认定。因此，建立能够实现对混合精斑中不同个体分别同一认定的检测方法是亟待解决的问题。
　　基于mtDNA具有遗传多态性，且在细胞中拷贝数量较多;X染色体STR在男性中为单倍体，易于分析。本研究拟将常染色体、Y染色体、X染色体的STR检测技术与mtDNA高变区Ⅰ测序分析技术联合应用，探讨二人混合精斑中不同个体的鉴别方法;应用LCM技术捕获单一精子细胞，通过对mtDNA高变区的PCR扩增与序列分析，获得混合精斑中具有个人性的精子，实现同一认定的目的;同时，探讨PCR循环次数和扩增体系对DNA检验灵敏度的影响。
　　材料和方法:
　　1.样品中国汉族10例无血缘关系健康志愿者个体精液，提取DNA。已确定常染色体、Y、X-STR与mtDNA HVⅠ区型别。
　　2.STR分型应用PowerPlex(@)16HS、PowerPlex(@)Y、Investigator(@)Argus X-12试剂盒，检测随机二人组合不同比例的混合样品的常染色体、Y、X-STR。
　　3.精子捕获应用LMD7000型徕卡激光显微切割系统捕获混合精斑涂片中单精子细胞，提取DNA。
　　4.mtDNA HVⅠ区扩增与测序应用PCR方法，以KOD-Plus-Neo酶对2与3中的样品扩增mtDNA HVⅠ区片段，对扩增产物进行DNA序列分析。
　　5.精子的STR分型收集mtDNA型相同的精子DNA，检测常染色体STR。
　　6.循环参数与扩增体系实验对倍比稀释的DNA样品以不同容积体系和循环参数检测常染色体STR。
　　结果与讨论:
　　mtDNA与X染色体STR在男性中为单倍体遗传，易于区分无关个体，加之常染色体STR与Y染色体STR组成的四个遗传标记系统相互独立。极大的提高了个人识别能力，而达到同一认定水平。
　　DNA量差为3∶7～1∶10时，可区分高、低拷贝个体的Y、X-STR基因型，常染色体为不同杂合子和相同纯合子时的基因型及高拷贝者的mtDNA单倍型，推测低拷贝者的mtDNA单倍型;量差接近5∶5时，不能分别获得个体信息。当满足两个犯罪嫌疑人均不能排除并四个遗传标记系统的基因型可全覆盖混合样品检出的基因型时，可作同一认定;量差大于1∶11时，仅能获得高拷贝的个体信息。提示应建立Y与X-STR及mtDNA数据库;提取检材时最好分部位。
　　根据Y染色体与mtDNA的遗传特点结合四个遗传标记系统的检测结果综合分析，应用同胞、半同胞或其他亲缘关系鉴定的计算公式，也可提供犯罪嫌疑人之间可能具有的亲缘关系线索。
　　单精子mtDNA的检出率为62.5％～90％，根据mtDNA HVⅠ区序列的差别有98％的可能区分无关个体，20个以上精子DNA富集后可正确地进行常染色体STR分型，实现同一认定。建议要及时取材;捕获完整精子;PCR扩增使用KOD-Plus-Neo酶;第一次扩增失败可提高模板量;常染色体STR分型时以30个以上精子DNA富集为好。
　　PCR循环次数增加到34次，扩增体系为3μ L时可对20pg DNA的常染色体STR正确分型，扩增体系减小使DNA相对浓度增加，可提高检测敏感度。
　　根据本研究建立的方法，可在某种程度上解决其他性质混合样品的个人识别问题;在满足精液混合检材中充分含有每个个体的精子细胞的前提下，理论上，多人精液混合检材也可实现对每个个体同一认定的目的。
　　结论:
　　常染色体、Y染色体、X染色体STR与mtDNA HVⅠ区的联合检测，可以对二人混合精斑在一定程度上实现个体同一认定; LCM技术捕获单一精子结合mtDNA分型技术可以有效地解决混合精斑中个体的个人识别问题;3μL扩增体系经34次循环可对20pg的DNA样本正确分型。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 二人混合精斑四个遗传标记系统DNA分型的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文二 激光捕获单精子mtDNA分型鉴别混合精斑个体

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文三 循环参数与小体系对提高DNA检测敏感度的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新性的自我评价

综述 混合斑及微量检材检验分析的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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