1,25(OH)2D3通过let-7e下调EZH2增强卵巢癌对顺铂敏感性的研究

摘要

目的：
　　课题组前期体外实验发现，维生素 D3（1,25(OH)2D3）可增加上皮性卵巢癌对顺铂的敏感性，且与组蛋白甲基转移酶E ZH2的表达下调有关。本研究旨在阐明维生素D3（1,25(OH)2D3）通过激活let-7e下调耐药相关靶基因EZH2表达，增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性的作用和机制。
　　方法：
　　1.不同浓度梯度和时间梯度的1,25(OH)2D3处理上皮性卵巢癌细胞ES2、A2780后，蛋白免疫印迹（WB）检测EZH2、VDR、H3K27me3蛋白表达水平的变化；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测EZH2在转录水平的变化。
　　2.不同浓度梯度和时间梯度的1,25(OH)2D3处理上皮性卵巢癌细胞ES2、A2780后，实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 let-7e的表达水平的变化。给予10 nM1,25(OH)2D3处理A2780细胞后，ChIP检测VDR能否直接结合于let-7e的启动子区。
　　3. let-7e转染下调上皮性卵巢癌细胞let-7e的表达。qRT-PCR检测let-7e的转染效率。单独给予10 nM的1,25(OH)2D3或同时let-7e inhibitor处理上皮性卵巢癌细胞：空白对照组，1,25(OH)2D3组和let-7e inhibitor+1,25(OH)2D3组。WB和qRT-PCR检测EZH2的表达水平。
　　4.建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，每组5只裸鼠，共三组。分别为：对照组，顺铂组和1,25(OH)2D3联合顺铂组。对照组给予生理盐水和无水乙醇腹腔注射；顺铂组给予顺铂腹腔注射；1,25(OH)2D3联合顺铂组给予1,25(OH)2D3和顺铂腹腔注射。每两天测量一次皮下瘤瘤径，观察裸鼠一般情况。
　　5.裸鼠处死后，剥离皮下瘤，一部分石蜡包埋，一部分液氮保存。免疫组织化学法检测移植瘤中EZH2、VDR和H3K27me3的表达水平；原位杂交检测let-7e在移植瘤中的表达； TUN EL检测移植瘤组织中的细胞凋亡情况。
　　结果：
　　1.在卵巢癌细胞ES2、A2780中，给予不同浓度或时间梯度的1,25(OH)2D3处理后， EZH2、H3K27me3的蛋白表达水平均逐渐降低，同时VDR的蛋白表达均逐渐升高，且呈浓度和时间梯度依赖性；EZH2的 mRN A水平均随1,25(O H)2D3给药浓度的增加或给药时间的延长而下调。
　　2.在卵巢癌细胞ES2、A2780中，let-7e的mRNA表达水平均随1,25(O H)2D3作用而上调，且呈浓度梯度依赖性和时间梯度依赖性。ChIP结果显示 VDR能直接结合于let-7e的启动子区。
　　3. ES2、A2780细胞转染 let-7e inhibitors后 let-7e的表达均明显下调。1,25(OH)2D3下调EZH2的作用可被let-7e inhib ito rs削弱。
　　4.裸鼠在体实验结果显示：顺铂组以及顺铂联合1,25(OH)2D3组中的卵巢癌皮下瘤体积均明显小于对照组，同时顺铂联合1,25(OH)2D组中的皮下瘤体积也小于顺铂组。
　　5.免疫组织化学法结果显示：与顺铂组相比，顺铂联合1,25(OH)2D3组的皮下瘤组织中EZH2、H3K27me3的表达信号均较弱；同时VDR的阳性信号明显增强。原位杂交和TUNEL结果显示联合用药组中卵巢癌皮下瘤较顺铂组let-7e的表达量升高，细胞凋亡表达信号增强。
　　结论：
　　1,25(OH)2D3通过激活let-7e下调EZH2，从而增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，促进卵巢癌细胞的凋亡。

目录

声明

1 前 言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 细胞培养

2.3 实时荧光定量PCR

2.4 蛋白免疫印迹

2.5 染色质免疫沉淀

2.6 let-7e inhibitor细胞转染

2.7 动物实验

2.8 统计学分析

3 结 果

3.1 1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞EZH2表达的影响

3.2 1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞let-7e表达的影响及机制

3.3 1,25(OH)2D3通过let-7e调控EZH2

3.4 1,25(OH)2D3增加裸鼠皮下瘤对顺铂的敏感性

4 讨 论

参考文献

综述:维生素D抗癌作用机制的研究进展

附录

致谢