干细胞微囊泡缓解实验性结肠炎及其相关肠纤维化和复方苦参汤的协同作用研究

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 骨髓间充质干细胞来源微囊泡的鉴定
　　目的：大鼠全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，经血清饥饿处理，收集并鉴定BMSCs来源的MVs，为后续试验打下基础。
　　方法：取体重80-100g的SD大鼠，于无菌条件下分离胫骨、股骨，体外分离、培养并纯化BMSCs，流式细胞学鉴定。得到的BMSCs经血清饥饿处理，将其上清液低温超速离心，获得BMSCs来源的MVs，并用电镜及流式细胞学鉴定。
　　结果：全骨髓贴壁法得到呈旋涡状排列的梭形 BMSCs，生长状况良好，流式细胞学鉴定其高表达CD90和CD29，不表达CD45和CD11b。BMSCs来源的MVs在电镜下呈圆形或椭圆形的囊状结构，其直径大约在500nm左右，经流式细胞学鉴定MVs大小与理论值相符。
　　结论：全骨髓贴壁法可以获得生长状态良好，纯度较高的 BMSCs，经流式细胞学鉴定满足BMSCs特征。血清饥饿处理合并低温超速离心的方法，可以得到状态稳定的MVs，经电镜及流式细胞学鉴定其大小形态符合MVs特征。
　　第二部分 干细胞微囊泡对实验性结肠炎的治疗及复方苦参汤的协同作用研究
　　目的：研究BMSCs来源MVs在抗炎、抗氧化以及抗凋亡方面对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的IBD大鼠模型的治疗作用以及复方苦参汤的协同效应。
　　方法：体重在160-180g左右的SD大鼠，随机分为4组：正常对照组、模型组、MVs组和 MVs+中药组（MVs+TCM组，二联组）。采用 TNBS/乙醇灌肠，构建实验性结肠炎大鼠模型。对各组大鼠一般情况及疾病活动指数进行评估，免疫组化、western blot及PCR等方法检测结肠核因子ΚB（NF-ΚB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）、白介1β（IL-1β）、白介10（IL-10）等炎症反应相关分子，髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）等氧化应激相关分子，以及剪切后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（c-caspase3），剪切后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8（c-caspase8），剪切后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（c-caspase9）等凋亡相关分子的表达情况。
　　结果：在炎症性指标方面，与模型组相比，MVs组和二联组可以显著降低NF-ΚB,TNF-α,iNOS,COX-2等炎性介质的mRNA和蛋白的表达，降低IL-1β蛋白的表达，升高抗炎因子IL-10的水平。在氧化应激反应相关指标方面，与模型组相比， MVs组和二联组可以降低氧化介质MPO和MDA的表达，升高抗氧化介质GSH和SOD的表达水平。在凋亡相关指标方面，与模型组相比，MVs组和二联组可以降低 c-caspase3，c-caspase8，c-caspase9的表达。且各指标中，二联组效果均优于MVs组。
　　结论：MVs可以从抗炎、抗氧化、抗凋亡三个反面缓解TNBS诱导的实验性结肠炎，复方苦参汤在MVs对实验性结肠炎的治疗作用中起到协同作用。
　　第三部分 过表达 miR-200b的干细胞微囊抑制实验性结肠炎相关肠纤维化的细胞外基质沉积及复方苦参汤的协同作用研究
　　目的：初步探讨过表达miR-200b的干细胞来源MVs对实验性结肠炎相关性纤维化的细胞外基质沉积的抑制效果，以及复方苦参汤的协同治疗作用。
　　方法：构建过表达miR-200b的慢病毒载体，转染第四代BMSCs，经药筛得到稳定过表达miR-200b的BMSCs，将这些细胞经血清饥饿处理后，低温超速离心其上清液，得到过表达miR-200b的干细胞MVs（下文简称：miR-200b-MVs），并经PCR鉴定其miR-200b的表达水平。大鼠被随机分为5组：正常组、模型组、null-MVs组（阴性病毒转染的干细胞产生的MVs）、miR-200b-MVs组（过表达miR-200b的慢病毒转染干细胞产生的MVs），和miR-200b-MVs+中药复方苦参汤组（二联组）。采用 TNBS/乙醇多次灌肠法诱导实验性结肠炎相关性肠纤维化模型。每组予以相应的处理，6周后收取结肠组织进行病理学分析， western blot检测细胞外基质相关指标纤连蛋白（ fibronectin）、Ⅰ型胶原（collagenⅠ）、Ⅲ型胶原（collagenⅢ）的表达。
　　结果：成功构建过表达miR-200b的慢病毒表达载体，转染BMSCs，并成功获得稳定过表达 miR-200b的干细胞 MVs。与正常组相比，模型组 fibronectin、collagenⅠ、collagenⅢ的表达明显升高；与模型组相比，微囊泡组、miR-200b-MVs组和二联组都可以降低fibronectin、collagenⅠ、collagenⅢ的表达水平，其中以二联组的效果最佳。
　　结论：miR-200b-MVs可以减少实验性结肠炎相关性纤维化的细胞外基质沉积，复方苦参汤具有协同治疗作用。
　　第四部分 过表达 miR-200b的干细胞微囊泡通过抑制上皮间质转分化缓解实验性结肠炎相关肠纤维化及复方苦参汤的协同作用研究
　　目的：进一步探讨miR-200b-MVs通过抑制EMT缓解实验性结肠炎相关肠纤维化的作用机制及作用靶点。
　　方法：分为动物实验和细胞实验两部分；在动物实验部分，将大鼠随机分为正常组、模型组、null-MVs组（阴性病毒转染干细胞得到的MVs）、miR-200b-MVs组（过表达 miR-200b的慢病毒转染干细胞后得到的 MVs）、miR-200b-MVs+中药复方苦参汤组（以下简称：二联组）。用 TNBS/乙醇多次灌肠的方法构建实验性结肠炎相关性肠纤维化模型，western blot检测EMT相关蛋白E-cad、波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、ZEB1和ZEB2的表达情况，免疫荧光检测E-cad、成纤维细胞特异蛋白（FSP-1）和α-SMA的表达。在细胞实验中，细胞分为正常组、模型组、null-MVs组、miR-200b-MVs组。用细胞因子生长转化因子β（TGF-β）刺激大鼠小肠上皮隐窝细胞株（IEC-6），构建EMT模型，加入null-MVs或miR-200b-MVs后，观察细胞形态改变，western blot检测细胞E-cad，vimentin，ZEB1和ZEB2的表达情况。两部分都用PKH26染色过的null-MVs和miR-200b-MVs，来观察null-MVs和miR-200b-MVs在结肠的定植情况，以及null-MVs或miR-200b-MVs与IEC-6细胞的融合情况。
　　结果：在动物实验部分，发现通过追踪PKH26标记过的MVs和miR-200b-MVs发现， MVs和miR-200b-MVs可以在结肠定植，并且中药复方苦参汤对其向结肠归巢有促进作用。与正常组相比，模型组大鼠E-cad表达降低，vimentin、α-SMA、ZEB1和ZEB2的表达升高，经miR-200b-MVs以及复方苦参汤治疗后，与模型组相比，大鼠E-cad表达升高，vimentin、α-SMA、ZEB1和ZEB2的表达降低；在细胞实验部分，与正常组相比，模型组E-cad，表达减少，vimentin， ZEB1和ZEB2表达上升，加入miR-200b-MVs后，与模型组相比，E-cad，表达升高，vimentin，ZEB1和 ZEB2表达减少。二联组比单一的 null-MVs（或miR-200b-MVs）组更能促进E-cad的表达，抑制vimentin，ZEB1和ZEB2的表达。
　　结论：miR-200b-MVs可以通过降低间质细胞标志物vimentin、α-SMA、FSP-1的表达，促进上皮细胞标志物E-cad的表达，从而抑制EMT进程，其机制可能与抑制ZEB1和ZEB2有关。复方苦参汤可以在此过程中起来协同治疗作用。

目录

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中英文缩略词汇表

研究背景

第一部分 骨髓间充质干细胞来源微囊泡的获取及鉴定

1.1引言

1.2材料和方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

1.5参考文献：

第二部分 干细胞微囊泡对实验性结肠炎的治疗及复方苦参汤的协同作用研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5参考文献：

第三部分 过表达miR-200b的干细胞微囊抑制实验性结肠炎相关肠纤维化的细胞外基质沉积及复方苦参汤的协同作用研究

3.1引言

3.2材料和方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5参考文献：

第四部分 过表达miR-200b的干细胞微囊泡通过抑制上皮间质转分化缓解实验性结肠炎相关肠纤维化及复方苦参汤的协同作用研究

4.1引言

4.2材料和方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5参考文献：

全文技术路线：

总结：

附件一：综述:间充质干细胞来源的胞外囊泡的研究进展

附录二：攻读博士期间参与的课题

攻读博士期间发表的文章

致谢