Fgl2对重型肝炎巨噬细胞极化的影响研究

摘要

目的：重型肝炎病因多样，在我国主要由病毒性肝炎引起，临床上缺乏特异而有效的治疗靶点和干预手段，绝大部分患者预后不良。病理形态学和免疫学研究表明，早期微循环障碍、细胞凋亡对于重型肝炎的疾病进展至关重要。本研究所前期发现MHV-3引起的小鼠暴发性肝炎模型中，肝枯否细胞向M1极化，且M1上fgl2分子高表达，fgl2敲除后小鼠肝脏炎症减轻，M1极化减弱。本文采用体外细胞模型，深入研究 fgl2对巨噬细胞极化的影响及其与重型肝炎疾病进展的关系，为进一步阐明重型肝炎的免疫学发病机制提供依据，为重型肝炎新型治疗途径提供新靶点。
　　方法：⑴THP-1细胞经PMA+LPS诱导后，流式检测细胞表面CD80以及fgl2，Elisa检测上清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平，Real-time PCR检测fgl2及M1相关（iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β）的基因表达。⑵采用3%淀粉肉汤刺激分离野生型Balb/cJ小鼠以及Fgl2-/-小鼠腹腔巨噬细胞，体外加入MHV-3以模拟小鼠暴发性肝炎体内抗原刺激状态。⑶流式细胞术检测 MHV-3感染后巨噬细胞M1/M2的比例变化，以及 fgl2的变化。⑷CBA检测巨噬细胞（WT、fgl2-/-）感染 MHV-3后细胞上清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、IL-10、IL-12）的变化。⑸Real-time PCR检测巨噬细胞（WT、fgl2-/-）感染MHV-3后fgl2基因表达，M1相关基因(iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β)、M2相关基因（CD206、Arg1、TGF-β）表达差异。
　　结果：①THP-1细胞依次经PMA、LPS诱导后，向M1型极化并伴有fgl2表达升高。实验组与对照组相比，流式检测发现 CD80+（M1标记）比例明显升高（79.67±2.11% VS32.43±2.11%，P<0.001），CD80+的 M1中 fgl2表达升高（70.8±5.26%VS36.83±3.47%，P<0.001）；Elisa发现上清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的分泌增加；Real-time PCR检测fgl2及M1相关（iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β）的基因表达升高。②野生型Balb/cJ小鼠腹腔巨噬细胞经MHV-3病毒刺激后，向M1极化并伴有fgl2表达升高。实验组与对照组相比，流式细胞检测发现iNOS+（M1标记）占巨噬细胞标志F4/80+的比例升高，同时伴随fgl2的表达增加；CBA发现炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1升高，而IL-1β、IL-12、IL-10无明显差异；Real-time PCR检测发现fgl2及M1相关（iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β）基因表达升高，而M2相关（CD206、TGF-β）基因表达下降。③提取野生型和 fgl2敲除鼠腹腔巨噬细胞，MHV-3病毒刺激后，均向 M1极化，但fgl2敲除鼠M1极化比例下降。相同的病原刺激条件下，fgl2敲除鼠与野生型鼠相比，流式检测发现iNOS+（M1标记）比例降低；CBA结果显示炎症因子（TNF-α、IL-6、MCP-1）表达也下降；Real-time PCR显示M1相关（iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β）基因表达下降，而 M2相关（CD206、TGF-β）基因表达升高。
　　结论：⑴Fgl2可促进巨噬细胞向M1极化，抑制其向M2极化；⑵Fgl2与巨噬细胞向M1极化密切相关，但不是其极化所必须存在的分子，可能与其他分子存在协同作用。

目录

声明

英文缩略词对照表

引言

实验材料

1.病毒株

2.实验动物

3.细胞系

4.主要仪器设备

5.主要试剂

6.常用液体配置

实验方法

1.细胞复苏、培养与冻存

2.腹腔巨噬细胞的募集、提取及病毒刺激

3．流式细胞标记

4.提取巨噬细胞RNA

5.RNA浓度测定

6.逆转录

7.实时定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative PCR）

8.酶联免疫吸附实验（Elisa）

9.细胞因子微球检测（CBA）

10.统计学分析

实验结果

1.THP-1细胞依次经PMA、LPS诱导后，向M1型巨噬细胞极化并伴有fgl2表达升高。

2.野生型Balb/cJ小鼠腹腔巨噬细胞经MHV-3病毒刺激后，向M1型巨噬细胞极化并伴有fgl2表达升高。

3.提取野生型和fgl2敲除鼠腹腔巨噬细胞，MHV-3病毒刺激后，向M1型巨噬细胞极化，但fgl2敲除鼠M1极化比例下降。

讨论

参考文献

综述：Fgl2的功能及其与疾病的关系

致谢