长链非编码RNA-Gm26543在慢性社会挫败应激诱导的小鼠抑郁样行为中的作用及机制

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：
　　第一部分：lncRNA-Gm26543在慢性社会挫败应激诱导的小鼠抑郁样行为中的作用
　　目的：抑郁症是临床上常见的精神障碍之一，严重影响患者生活质量，并给社会带来巨大的经济负担。长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）调控是重要的表观遗传学调控机制之一，近年研究表明，lnc RN As调节神经突触可塑性，在多种生物学进程及神经系统疾病中发挥重要功能。通过芯片筛选，我们发现lncRNA-Gm26543在慢性社会挫败应激（chronic social defeat stress，CSDS）诱导的抑郁样小鼠前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）脑区具有差异性表达。本实验将探讨lncRNA-Gm26543对小鼠抑郁样行为的影响。
　　方法：采用CSDS诱导小鼠抑郁样行为；应用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法检测CSDS易感小鼠mPFC及其他脑区中lncRNA-Gm26543的mRNA水平；利用腺病毒（adenovirus，ADV）和腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）技术过表达小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543，研究lncRNA-Gm26543对小鼠抑郁样行为的影响；设计反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）序列，靶向沉默lncRNA-Gm26543，结合阈下社会挫败应激研究lncRNA-Gm26543对小鼠抑郁敏感性的影响。
　　结果：（1）CSDS易感小鼠表现出显著的抑郁样行为。qRT-PCR发现，CSDS易感小鼠mPFC脑区中lncRNA-Gm26543的表达水平相对于对照组下调，CSDS抵抗小鼠没有显著变化（n=8-11，P<0.01susceptible vs.control）。（2）CSDS易感小鼠多个脑区lncRN A-Gm26543表达发生改变，其中mPFC中的表达变化最明显。（3）过表达易感小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543可逆转其抑郁样行为。具体表现为：采用ADV过表达易感小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543后，在社会接触实验中，小鼠在tar ge t阶段的社会接触时间增加；在糖水偏好实验中，小鼠的糖水偏好增加。采用AAV过表达CSDS易感小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543基因后，在社会接触实验中，小鼠在target阶段的社会接触时间增加，小鼠的社会接触比率增加。（4）沉默正常小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543可使小鼠对阈下社会挫败应激的敏感性显著增加。
　　结论：CSDS可降低易感小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543基因表达水平，过表达mPFC脑区lncRNA-Gm26543明显改善CSDS引起的小鼠抑郁样行为；下调小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543表达水平增加小鼠对社会挫败应激的敏感性。提示小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543表达下降在抑郁症的发病中起到关键作用，上调小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543表达水平可能是抑郁症治疗的新策略。
　　第二部分：lncRNA-Gm26543介导慢性社会挫败应激诱导的小鼠抑郁样行为的机制
　　目的：lncRN A-Gm26543在CSDS易感小鼠mPFC脑区中显著下调，且外源性补充lncRNA-Gm26543可以逆转小鼠的抑郁样行为，本实验深入探索lncRNA-Gm26543对小鼠抑郁样行为的机制。
　　方法：运用荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization，FISH）确定lncRNA-Gm26543在细胞中的定位；利用生物信息学数据分析，寻找lncRN A-Gm26543的下游靶基因，检测预测靶基因在CSDS易感小鼠中的变化；过表达小鼠mPFC脑区lncRNA-Gm26543后，采用Agilent表达谱基因芯片（8×60K），筛选表达具有显著性差异的mRNA，验证部分具有显著差异性的mRNA与lncRN A-Gm26543的调节关系，并检测这些mRNA在CSDS易感小鼠中的变化；运用RNA-pulldown实验，获得与lncRNA-Gm26543形成lncRNA-protein复合物的直接相互作用蛋白，通过蛋白质质谱鉴定lncRNA-Gm26543的特异性结合蛋白，通过RIP实验验证lncRNA-Gm26543与质谱鉴定出的蛋白的直接相互作用。
　　结果：（1）经核质分离实验和FISH实验发现lncRN A-Gm26543在细胞核和细胞质中均有表达（n=5）。（2）根据生物信息学数据，lncRNA-Gm26543位于Chromosome10：49，219，422–49，225，653，属于基因内长链非编码RNA（intronic lncRNAs），基因座附近的蛋白编码基因为离子型谷氨酸海人藻酸受体2型亚基（glutamate ionotropic receptor kainate type subunit2，GriK2）。qPCR和western blot检测发现GriK2基因在CSDS易感小鼠mPFC脑区的mRNA和蛋白表达水平均没有显著变化（n=4-9）。（3）通过生物信息学预测，lncRNA-Gm26543通过trans的方式调节丝氨酸蛋白酶35（protease serine35，Prss35）、血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like4，Angptl4）、G蛋白信号调节蛋白9（regulator of G-protein signaling9，Rgs9）、TNF受体相关因子4（TNF receptor associated factor4，Traf4）以及髓样分化初级响应基因88（myeloid differentiation primary response gene88，Myd88）的mRNA水平。qPCR检测发现CSDS易感小鼠mPFC脑区中这五个基因的mRNA水平均没有显著变化；western blot检测Myd88的蛋白水平，与对照组相比，CSDS易感小鼠mPFC脑区中Myd88蛋白表达水平没有显著变化。（4）使用ADV过表达正常小鼠mPFC脑区中lncRNA-Gm26543，通过Agilent表达谱基因芯片，在39430条小鼠mRNAs和16251条lncRNAs中检测到1071个基因表达有差异性，其中1030个基因出现上调，41个基因出现下调。GO分析表明，表达有差异性的基因与恐惧行为、神经投射的建立、神经迁移、蛋白转运和磷酸化密切相关，主要定位于细胞质、细胞膜、细胞器、细胞骨架以及突触部分。（5）选取表达有差异性的基因中与突触可塑性密切相关的脑区钙/钙调蛋白依赖的丝氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase，CASK）、Disks大相关蛋白2（disks large-associated protein2，DLGAP2）和N-乙基马来酰亚胺-敏感因子（N-ethylmaleimide-sensitive factor，NSF）进一步研究。qPCR检测发现CSDS易感小鼠mPFC脑区CASK的mRNA表达水平降低，蛋白表达水平降低；DLGAP2的mRN A表达水平降低，蛋白表达水平降低；NSF的mRNA水平降低，蛋白表达水平降低。（6）采用ADV过表达小鼠神经母瘤细胞N2a细胞（mouse neuroblastoma N2a cells，N2a细胞）lncRNA-Gm26543后，qPCR检测发现CASK的mRN A水平上调；蛋白表达水平上调；DLGAP2的mRN A水平上调，蛋白表达水平上调；NSF的mRNA表达水平上调，蛋白水平上调。（7）采用ASO-395沉默N2a细胞lncRNA-Gm26543后，qPCR检测发现CASK的mRNA水平下调，蛋白水平下调；DLGAP2的mRNA水平下调，蛋白水平下调；NSF的mRNA表达水平下调，蛋白表达水平下调。（8）采用免疫荧光的方法发现CSDS易感小鼠mPFC脑区中NSF和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体亚单位2（AMPA receptor subunit2，GluA2）的共定位显著减少过表达lncRNA-Gm26543后NSF和GluA2的共定位显著增加；western blot检测发现CSDS易感小鼠mPFC脑区GluA2的膜表达显著降低，而总蛋白表达水平没有变化。（9）过表达N2a细胞lncRNA-Gm26543后，NSF与GluA2的共表达显著增加。（10）CSDS易感小鼠mPFC脑区的树突棘数目明显减少，采用AAV特异性过表达易感小鼠mPFC脑区的lncRNA-Gm26543水平，可逆转树突棘数目的减少。
　　结论：lncRNA-Gm26543对慢性社会挫败应激引起的小鼠抑郁样行为的调节具有多靶点网络式调控的特点。lncRNA-Gm26543对中枢神经系统突触可塑性相关基因CASK、DLGAP2和NSF的mRNA和蛋白表达水平具有调控作用，可以促进NSF与GluA2的结合，逆转CSDS易感小鼠mPFC脑区神经元树突棘丢失。并通过直接结合Map1a蛋白，调节突触可塑性。lncRNA-Gm26543可以作为抑郁症治疗和抗抑郁药物研发的重要靶点。

目录

声明

缩略词表（ Abbreviations）

前言

第一部分 lncRNA-Gm26543在慢性社会挫败应激诱导的小鼠抑郁样行为中的作用

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 lncRNA-Gm26543介导慢性社会挫败应激诱导的小鼠抑郁样行为的机制

材料和方法

结果

讨论

小结

全文总结

本文创新点

展望

参考文献

综述：长链非编码RNA在神经系统突触可塑性和疾病中的作用

攻读博士学位期间已发表和待发表的论文

致谢