温敏性纳米载体共输送阿霉素和干扰素γ用于黑色素瘤的免疫化疗研究

摘要

目的：采用化疗药物治疗肿瘤时，由于特异性差，在杀伤肿瘤的同时，会损伤正常细胞，且容易引起耐药，限制了化疗药物在肿瘤治疗中的应用，随着免疫治疗的兴起，弥补了化疗的不足，不仅能够特异性的杀伤肿瘤，降低化疗药物的毒性，还能增加肿瘤对化疗药物的敏感性，同时一些化疗药还能引起抗肿瘤的免疫反应，将二者结合，可以协同治疗肿瘤。本实验为实现温敏性纳米粒（TSNs）介导的免疫化疗治疗黑色素瘤，构建了两种分别以pH敏感型和非pH敏感型载药的TSNs纳米粒，实现对化疗药物阿霉素（DOX）和免疫药物干扰素γ（IFNγ）的共递送。 方法：利用纳米沉降法制备温敏性纳米粒，在已构建的温敏性纳米载体（TSNs）的基础上，通过腙键或者酰胺键化学偶联化疗药物DOX和利用载体自身温敏性及静电作用力吸附细胞因子IFNγ，实现化疗免疫药物的共输送，接着比较酰胺键偶联和腙键偶联方法对DOX体外释放行为的影响，结合C57BL/6小鼠黑色素瘤模型的治疗效果，筛选出相对较好的化学偶联方式载药的纳米粒，并通过ELISA、流式细胞仪、免疫组化和激光共聚焦对联合治疗的机制进行分析。 结果：合成的载药纳米粒大小均一，形貌规整，具有明显的核壳结构，对DOX和IFNγ有很好的包载。通过一系列体外和体内实验，确定pH敏感的腙键偶联方式更有利于DOX释放，联合IFNγ在黑色素瘤小鼠体内能发挥明显的抑瘤效果，同时能活化Th1CD4+T细胞、毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK），进而激活免疫系统对肿瘤的杀伤。 结论：成功构建了以化学偶联方式载药的TSNs纳米粒，实现对化疗药物DOX和细胞因子IFNγ的共递送，以腙键方式载药的纳米粒无论在体外药物释放还是在黑色素瘤小鼠体内的治疗实验中，释药能力和抑瘤效果都明显优于酰胺键偶联。通过对比，确定最终采用腙键偶联方式载药的纳米粒DOX/IFNγ-TSN(hyd)，该纳米粒能通过高通透滞留效应（EPR）效应和内吞作用被动靶向进入肿瘤细胞，在溶酶体微酸环境（pH5-6）下，敏感键会水解断裂，释放出游离DOX，实现药物的持续缓慢释放，由于该纳米粒体带负电性多于酰胺键组DOX/IFNγ-TSN(ami)，所以能通过静电作用力吸附更多的IFNγ，跟其他对照组相比，表现出更好的抗肿瘤效果，并且能够激活固有免疫和适应性免疫应答，进而启动抗肿瘤的免疫机制。

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