抗PCSK9治疗性短肽疫苗的研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 抗PCSK9短肽表位的筛选及其载体疫苗功能研究 研究目的：前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）自2003年发现以来一直备受广泛关注，由于它能与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）结合，使后者进入内质网/溶酶体被降解而不能再循环表达于细胞膜上，从而降低LDLR水平并达到升高低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的效果，因此PCSK9成为治疗高胆固醇血脂甚至动脉粥样硬化性心血管病的新靶点。迄今为止，PCSK9抑制剂的研究也是层出不穷，包括单克隆抗体（简称单抗）、反义寡核苷酸、疫苗等，其中部分研究取得相应的成果，尤以单抗的研究最多，但由于其价格昂贵，半衰期短等原因而限制了在临床上的应用。由于疫苗有给药剂量小，制备成本低，经济负担降低等在治疗慢性病上的优势，所以针对PCSK9疫苗的研究就显得尤为重要。本研究的目的主要为了筛选出多个不同的针对PCSK9的短肽表位，并将短肽分别与载体偶联成疫苗，免疫动物，继而验证是否有降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和/或总胆固醇（TC）的效果，从而为高胆固醇血脂的防治提供一种新的手段。 研究方法：首先，应用相关的网站和软件分析技术针对PCSK9蛋白的结构和氨基酸序列筛选出多种可能成为免疫表位的短肽。其次，利用本课题组所掌握的疫苗制备技术，分别将筛选出来的短肽通过异双功能交联剂Sulfo-SMCC（Pierce,USA）与载体Qβ-VLP进行耦联，用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定分析疫苗的偶联率。再次，在体验证疫苗的效应。以6周龄雄性BalB/C作为实验动物，将制成的疫苗后对齐进行背部皮下多点注射免疫，整个实验需要观察的指标如下：1.抗体滴度测定：分别检测不同的疫苗免疫后Anti-PCSK9抗体滴度及维持状况。2.血脂监测：定期检测总胆固醇（TC)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）四项指标。3.实验结束分别用WB和qRT-PCR检测肝脏组织LDLR水平等。 研究结果：1.总共筛选出15个可作为免疫表位的短肽，氨基酸数目为别为7-10个不等。2.部分针对PCSK9的载体疫苗可以在动物体内产生高滴度的Anti-PCSK9抗体，滴度经过3-4次免疫强化后可以维持在较高水平，并直到实验结束。3.其中的一个载体疫苗PCSK9Qβ-003能够降低实验动物的血脂水平，尤其以LDL-C和TC显著，但是不影响TC和HDL-C。4.PCSK9Qβ-003疫苗无论从蛋白还是mRNA水平均能增加肝脏组织LDLR的表达量。 研究结论：针对PCSK9的15个短肽偶联载体制成的疫苗中，其中PCSK9Qβ-003疫苗可以在Balb/c动物体内产生较高并稳定的抗体滴度水平，并且能够降低动物的LDL-C和TC。因此PCSK9Qβ-003疫苗可能成为治疗高胆固醇血症的一种新方法。 第二部分 PCSK9Qβ-003疫苗在LDLR+/-小鼠模型上的功能研究 研究目的：本研究一方面为了进一步验证PCSK9Qβ-003疫苗在LDLR+/-小鼠模型中的降脂效果，另外还研究了PCSK9Qβ-003疫苗是否能在LDLR+/-小鼠模型中对胆固醇代谢途径的产生影响以及验证PCSK9Qβ-003疫苗是否安全可靠，便于今后此疫苗能应用于高胆固醇血症的临床治疗。 研究方法：以6周雄性LDLR+/-小鼠作为实验动物，来研究PCSK9Qβ-003疫苗的功能。主要包括以下几方面：1.抗体滴度测定：检测PCSK9Qβ-003疫苗免疫后Anti-PCSK9抗体滴度及维持状况。2.血脂监测：定期检测总胆固醇（TC)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）四项指标。3.血清样本检测：分别用ELISA检测血清中PCSK9的总含量和游离PCSK9含量。4.肝脏组织标本检测：用Western Blot和qRT-PCR分别检测LDLR,SREBP-2,HNF-1α和HMG-CoA还原酶的表达量等。5.安全性研究：取新鲜脾脏组织用流式细胞数检测Th1,Th2和Th17细胞比率，用血标本检测肌酐，尿素氮及部分炎症因子的水平，另外取肾脏组织做HE，Masson和PAS染色观察PCSK9Qβ-003疫苗的影响。 研究结果：1.PCSK9Qβ-003疫苗可以刺激LDLR+/-小鼠产生高滴度的Anti-PCSK9抗体，滴度经过3-4次免疫强化后可以维持在比较高的水平，并直到实验结束。2.PCSK9Qβ-003疫苗能够降低LDLR+/-小鼠的血脂水平，尤其以LDL-C和TC显著，但不影响TC和HDL-C。此外，联合他汀药物治疗后可以将TC降低的更明显。3.PCSK9Qβ-003疫苗可以升高血清PCSK9总含量，但降低游离PCSK9的含量。4.PCSK9Qβ-003疫苗能显著性增加肝脏组织LDLR基因水平和蛋白水平的表达量，另外此疫苗还可以增加SREBP-2,HNF-1α和HMG-CoA还原酶的表达量。5.接受PCSK9Qβ-003疫苗免疫的小鼠中Th1,Th2和Th17细胞比率，血清肌酐，尿素氮和部分炎症因子的含量，以及肾脏组织的HE，Masson和PAS染色均未见异常。 研究结论：PCSK9Qβ-003疫苗可以降低LDLR+/-小鼠的血脂尤其TC和LDL-C，并增加肝脏LDLR含量，影响胆固醇代谢。而且PCSK9Qβ-003疫苗并不带来血清学、肾脏大体及肾功能等方面的损害。因此我们推断PCSK9Qβ-003疫苗可以作为治疗高胆固醇血症甚至动脉粥样硬化性心血管病的一种新手段。

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