Pseudomonas putida KT2440发酵碱木素合成聚羟基脂肪酸酯的研究

摘要

木质素作为植物细胞壁的主要成分之一，是地球上第二丰富的可再生生物质资源。造纸黑液是工业木质素最主要的来源，全球黑液碱木素（Kraft lignin）的年产量高达60万吨以上。Pseudomonas putida（恶臭假单胞菌）等微生物能以木质素及其衍生物为碳源合成聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA），在木质素高值化利用中表现出广泛应用前景，但碱木素转化效率受到其高度缩合的聚合结构的限制。本论文系统研究了P.putida KT2440生物转化造纸黑液合成PHA的特征，在此基础上，通过模拟真菌胞外自由基介导的木质素氧化反应增强碱木素解聚和开环，促进PHA转化，并揭示氧化产物的转化规律。 首先，优化了P.putida KT2440生物转化造纸黑液合成PHA的条件，使PHA的最大产量达154.0±12.6mg/L。通过对发酵前后碱木素结构表征和小分子物质分析发现，P.putida KT2440能一定程度断裂碱木素C-O-C连键，并脱除甲氧基，但对高含量C-C连键降解率很低。而黑液中的2-羟基丁酸、丙二酸、丁二酸、延胡索酸等有机酸及对羟基苯甲酸、没食子酸、香草酸等小分子芳香族化合物显著降解，表明P.putida KT2440主要利用黑液中的小分子化合物为碳源合成PHA，而高度缩合的结构是碱木素生物转化的主要限制因素。 其次，进一步利用Fe-EDTA与H2O2模拟真菌自由基介导的木质素降解反应氧化碱木素，以促进PHA合成。结果表明，碱木素降解率随着模拟体系中羟自由基的增加而增加。比较不同模拟体系处理对PHA发酵的影响，发现模拟体系可以显著增效碱木素转化，在2mmol/L Fe-EDTA和2mol/L H2O2条件下处理后碱木素转化PHA的产量最高，达到196.2±24.7mg/L。机理研究发现，模拟体系处理导致碱木素C-O-C和C-C连键均显著断裂，甲氧基降解率超过30%，小分子芳香族化合物和有机酸含量显著增加，表明碱木素发生了解聚和开环。模拟体系处理产生的碱木素解聚和开环产物在P.putida KT2440发酵过程中显著降解，其中对羟基苯甲酸、香草酸、丁二酸等降解率最高，说明这些经自由基降解木质素体系产生的小分子化合物更容易被P.putida KT2440利用，从而提高PHA产量。 最后，系统研究了P.putida KT2440利用碱木素解聚和开环产生的11种小分子木质素氧化产物合成PHA的规律。当以木质素解聚产生的芳香族化合物为碳源时，PHA产量和发酵时间与芳香族化合物的甲氧基数目和侧链结构有关，发酵27h后，对羟基苯甲酸转化PHA的产量最高，达到249.5±9.6mg/L。当以木质素开环产生的有机酸和甘油合成PHA时，与芳香族化合物为碳源时相比，菌体更易生长。其中以甘油为碳源时PHA产量最大，达到329.6±1.2mg/L，以有机酸为碳源时，乳酸转化的PHA产量最大，达到284.1±6.0mg/L。以上结果证实P.putidaKT2440能广泛利用木质素解聚和开环产物为唯一碳源合成PHA。 本研究通过模拟体系将木质素真菌降解策略与细菌转化途径相结合，增强碱木素PHA的转化，为构建新型的木质素高值化利用途径奠定基础。

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