tmTNF-α组成性活化NF-кB非经典途径的分子机制及其在白血病细胞耐药中的作用

摘要

大量文献报道证实TNF-α可被多种血液系统肿瘤细胞表达，且参与多种血液系统肿瘤的病理过程。跨膜型TNF-α（tmTNF-α）表达在细胞表面，经TNF-α转化酶酶解释放可溶性TNF-α，留其N末端片段（NTF）在细胞膜上。跨膜TNF-α以细胞与细胞接触的方式发挥作用，既可以作为配体向靶细胞传递正向信号，亦可作为受体向表达tmTNF-α的细胞本身传递反向信号。前期工作证实：高表达tmTNF-α的白血病细胞抵抗化疗药物（如阿霉素）的杀伤。并证实tmTNF-α可通过其反向信号组成性活化白血病恶性肿瘤细胞的NF-кB非经典途径。本研究旨在进一步探索tmTNF-α组成性活化NF-кB非经典途径的分子机制及其在白血病耐药中发挥的作用。其主要结果如下： 1.tmTNF-α组成性活化NF-кB非经典途径对TRAF1的依赖性 （1）构建稳转tmTNF-α的HEK293细胞，转染NIK和/或TRAF1，WB结果表明在只有在表达tmTNF-α的细胞，而非tmTNF-α阴性的亲本细胞，TRAF1才可促进NIK降解p100。提示TRAF1介导tmTNF-α诱导的NIK对p100的降解。 （2）构建稳转tmTNF-α或NTF的L82-T细胞，qPCR结果证实无论是tmTNF-α还是NTF对TRAF1-mRNA基因转录无影响，提示tmTNF-α不影响TRAF1的合成。 （3）用IP/WB实验证实在表达tmTNF-α的Raji和THP1白血病细胞系中，TRAF1、NIK、IKK?、p52可与tmTNF-α发生免疫共沉淀,活化NF-кB非经典途径，而tmTNF-α弱阳性的Jurkat细胞则没检测到相应信号。 2.TRAF1与tmTNF-α结合的结构域 利用PCR对TRAF1进行截短突变，将TRAF1及其突变体转染到过表达tmTNF-α的HEK293细胞，用IP/WB证实TRAF1N端1-146非TRAF结构域可与tmTNF-α共沉淀，而其TRAF结构域则无此能力。 3.tmTNF-α胞浆段磷酸化对其募集TRAF1的影响 由于可与TRAF结合的tmTNF-α胞浆段的N端片段含有CK1作用基序STES，本研究将此基序中2个丝氨酸进行单个或同时进行激活性突变成天冬氨酸，或失活性突变成丙氨酸，将tmTNF-α及其突变体与TRAF1共转染HEK293细胞，用IP证实无论是单个还是2个丝氨酸激活性突变，都可抑制tmTNF-α募集TRAF1，反之，失活性突变则可促进tmTNF-α募集TRAF1。提示tmTNF-α胞浆段脱磷酸化可促进其与TRAF1的结合。 4.TRAF1146位丝氨酸磷酸化对tmTNF-α募集TRAF1的影响： 用重叠PCR对TRAF1的146位丝氨酸进行激活性突变成天冬氨酸，或失活性突变成丙氨酸，将TRAF1及其突变体转染过表达tmTNF-α的HEK293细胞，用IP证实TRAF1146位丝氨酸激活性突变抑制tmTNF-α募集TRAF1，反之，失活性突变则可促进tmTNF-α募集TRAF1。提示TRAF1脱磷酸化可促进其与tmTNF-α的结合。 5．tmTNF-α反向信号组成性活化NF-B对白血病细胞耐药的影响: 用CK1抑制剂D4476和蛋白磷酸酶2A抑制剂LB100，分别抑制tmTNF-α的磷酸化和去磷酸化，结果证实抑制tmTNF-α的磷酸化可促进Raji和THP1对阿霉素的耐药，反之，抑制tmTNF-α的去磷酸化，则抑制Raji细胞p100降解为p52等的降解，增强该细胞株对阿霉素的敏感性。提示tmTNF-α反向信号可组成性活化NF-?B经典和非经典途径，导致白血病细胞耐药。 本研究主要揭示了TRAF1介导tmTNF-α反向信号诱导的NF-кB非经典途径的激活，阐述二者相互结合的结构域以及对二者丝氨酸脱磷酸化的依赖性，及其在白血病耐药中的作用。本研究为干扰tmTNF-α信号通路，阻断白血病耐药提供新的线索。

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