高木聚糖酶活性的HG-49工程菌构建及在苎麻生物脱胶中应用

摘要

苎麻纤维是一种性能优越的天然纺织纤维原料，应用广泛。它是由苎麻韧皮脱胶而来，苎麻韧皮大约含有30%的胶质，主要包含果胶、半纤维素、木质素和水溶物等。本课题组前期选育1株高效脱胶的软腐果胶杆菌HG-49，可使苎麻韧皮果胶去除率高达97.1%±2.8%，并实现工业应用，替代了传统酸水解，且显著降低了碱用量。但发现HG-49的木聚糖酶活性较低，导致苎麻韧皮中半纤维素去除不完全，本课题拟通过改造HG-49构建高木聚糖酶活性的基因工程菌，提高HG-49去除半纤维素的能力，从而进一步提高生物脱胶效果。取得研究结果如下： （1）克隆了一个内切β-(1→4)木聚糖酶基因Xylanase-Y（EC3.2.1.8），研究了xylanase（Xylanase-Y去除信号肽后形成的Xylanase的表达产物）的酶活性质，并证实xylanase对HG-49苎麻脱胶具有促进作用。从枯草芽孢杆菌HR-5中克隆得到的Xylanase-Y，大小为642bp，去除信号肽后构建了原核表达载体Xylanase-pGEX4T-1BL21）。诱导表达后纯化蛋白并切除标签，分析其酶活性质发现：xylanase适应的pH和温度范围较宽，分别为pH5.0-8.0和30-55℃，最适pH和温度分别为6.0、50℃；此外，发现Fe2+、Mn2+对xylanase酶活性具有一定的促进作用，而Cu2+、Ag+、Cr3+则有一定的抑制作用；以榉木木聚糖为底物测得的动力学常数Vmax=21.98μmol/(min?mL)，Km=3.71mg/mL；xylanase与HG-49联合脱胶较HG-49单独脱胶的脱胶率提高了3.1%。 （2）构建了木聚糖酶组成型分泌表达载体p213，并转入HG-49使其木聚糖酶活性得到显著提高。探索了pGEX4T-1上的pMB1复制子及tac表达系统在HG-49中发挥功能的可行性。扩增pGEX4T-1上的tac启动子、终止子、复制子、抗性筛选区以及HG-49內源信号肽，然后将它们与Xylanase利用融合PCR技术拼接成一个木聚糖酶组成型分泌表达的载体p213。结果发现，p213在大肠杆菌中可表达高活性的xylanase；将p213导入HG-49，并进行转录水平及酶活性水平分析，验证了p213在HG-49中的功能，且p213的引入使HG-49整体木聚糖酶活性显著提高，其中，胞外木聚糖酶活性提高了22倍，胞内的木聚糖酶活性提高了30倍。 （3）研究了高木聚糖酶活性的工程菌p213（HG-49）在苎麻脱胶中的作用，发现其脱胶率在高效脱胶的野生菌81.2%±1.2%基础上进一步提高到85.1±1.4%，提高了约3.9%。工程菌与野生菌相比，种子液制备期生长状态相似；但在苎麻脱胶过程中pH较低，脱胶终止时的脱胶液OD较高；果胶酶活、甘露聚糖酶活、纤维素酶活大小及活性变化相似而木聚糖酶活性显著提高，整个过程中木聚糖酶活性平均提高了13.34倍；半纤维素去除率由HG-49的74.0±1.5%提高到了81.4±2.4%，提高了7.4%，总胶质去除率在HG-4981.2%±1.2%基础上进一步提高到85.1±1.4%，提高了约3.9%，其中多去除的胶质中有90%是半纤维素。通过扫描电镜观察，工程菌脱胶后的胶质残余较少，脱胶效果很好。同时，p213（HG-49）在脱胶过程中质粒较稳定。 以上研究增强了HG-49对苎麻韧皮胶质中半纤维素的去除能力，为苎麻脱胶工业生产中进一步减少碱及漂白剂的用量，实现真正的清洁生产、绿色制造提供了理论和实验依据。

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