肌母细胞外泌体的制备及其治疗深二度烫伤的实验研究

摘要

深度大面积烧烫伤的临床治疗效果远不能达到患者的期望，留下的瘢痕也给患者带来极大的生理和心理创伤。找到一种更为有效的治疗方法迫在眉睫。外泌体是细胞分泌的直径为30-150nm的双层膜结构的囊泡，它不仅在细胞通讯和免疫调节中起作用，其组织修复功能近年来也倍受关注。肌母细胞外泌体与干细胞外泌体相比，产量更能满足烧烫伤临床需要并且稳定性更高。本课题以体内外模型为对象，研究了肌母细胞外泌体治疗烫伤的效果及其机制。取得如下主要研究结果： （1）建立了诱导鼠源肌母细胞C2C12分化促进其外泌体分泌的培养条件，并通过超速离心方法分离获得鼠源肌母细胞C2C12外泌体（以下简称C2C12-Ex）。诱导分化条件培养基为：含1%马血清和0.3%胰岛素的高糖DMEM。动态光散射和透射电镜分析所获得的肌母细胞外泌体为圆形或椭圆形并具备双层膜结构，粒径为100nm左右；进一步采用蛋白免疫印迹分析，发现所获得的外泌体中含有大量的外泌体标记蛋白CD63和TSG101；以上结果证明通过超速离心方法成功获得肌母细胞外泌体。并采用BCA蛋白定量方法确定外泌体的产率为2mg外泌体蛋白/1000mL条件培养基。 （2）建立了体外热激小鼠成纤维细胞损伤模型，发现C2C12-Ex对该模型的细胞有明显的促增殖和抗凋亡效应。分别在40℃、43℃、46℃条件下热水浴刺激小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1和成纤维细胞L92940min，在不同时间对细胞计数，结果显示，43℃刺激40min为最适造模温度；在选定的造模条件下，研究了C2C12-Ex对细胞损伤模型的修复效果，对增殖蛋白PCNA和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达进行分析，结果显示，C2C12-Ex能在该细胞损伤模型中促进PCNA和Bcl-2的表达，表明C2C12-Ex对体外热激受损的成纤维细胞3T3-L1和L929有明显的促增殖和抑凋亡效应。 （3）建立了SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型，并研究了C2C12-Ex对该模型的治疗效果及可能机制。烫伤愈合实验发现，C2C12-Ex能显著促进大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合，且具有剂量效应；对创面组织角质细胞的表面标记CK19、增殖核抗原PCNA和新生血管标记CD31的表达进行分析，发现C2C12-Ex能加速创面更完整地完成表皮再生的过程，并能提前促进细胞和血管大量再生；对各组胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白ⅢmRNA表达的分析发现，C2C12-Ex在创面愈合过程中，能优化烫伤创面皮肤组织胶原的产生，减少瘢痕的形成。 以上研究结果为肌母细胞外泌体C2C12-Ex治疗深Ⅱ度烫伤的临床应用提供了实验依据。

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摘 要

Abstract

目 录

1 绪论

1.1 烧烫伤概述

1.1.1 皮肤的结构与功能

1.1.2 烧烫伤分级与治疗进展

1.2 外泌体研究进展

1.2.1 外泌体的生物学特性和起源

1.2.2 外泌体分离与鉴定方法

1.2.3 外泌体的组成与功能

1.3 外泌体在烧烫伤中的研究进展

1.4 肌母细胞研究进展

1.5 本课题的研究意义及主要内容

1.5.1 研究意义

1.5.2 研究内容

2 C2C12外泌体提取与鉴定

2.1 实验材料

2.2.1 实验所用细胞

2.2.2 主要实验试剂

2.2.3 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 C2C12细胞诱导分化

2.2.2 C2C12细胞外泌体的分离

2.2.3 C2C12外泌体蛋白含量的测定

2.2.4 C2C12外泌体的鉴定

2.3 结果与讨论

2.3.1 C2C12诱导分化结果

2.3.2 C2C12-Ex外泌体蛋白含量测定

2.3.3 动态光散射和透射电镜鉴定C2C12-Ex实验结果

2.3.4 C2C12-Ex western blot实验结果

2.4 本章小结

3 C2C12-Ex对体外热激损伤成纤维细胞的影响

3.1 实验材料

3.1.1 实验所用细胞

3.1.2 主要实验试剂

3.1.3 主要实验仪器

3.2 实验方法

3.2.2 C2C12-Ex对热激损伤小鼠成纤维细胞的抗凋亡和促增殖实验

3.3 结果与讨论

3.3.1 细胞造模结果分析

3.3.2 C2C12-Ex对热激损伤小鼠成纤维细胞的促增值和抑凋亡效果

3.4 本章小结

4 C2C12-Ex治疗SD大鼠体内深II度烫伤效果研究

4.1 实验材料

4.1.1 实验所用动物

4.1.2 主要实验试剂

4.1.3 主要实验仪器

4.2 实验方法

4.2.3 荧光定量PCR

4.2.4 SD大鼠深II度模型建立和评估

4.2.5 C2C12-Ex对深II度烫伤创面治疗效果研究

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同烫伤时间造模后创面直观图像

4.3.2 不同烫伤时间造模后HE染色结果和CK19免疫荧光染色结果

4.3.3 治疗后各组烫伤创面愈合结果

4.3.4 治疗后各组烫伤创面皮肤组织HE染色结果

4.3.5 治疗后各组烫伤创面皮肤组织CK19、PCNA、CD31表达情况

4.3.6 治疗后各组烫伤创面皮肤组织胶原蛋白I和胶原蛋白III mRNA表达情况

4.4 本章小结

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

致 谢

参考文献

附录 主要符号的中英文对照表