GABAA受体活性依赖的Gephyrin棕榈酰化修饰在地西泮抗焦虑效应中的作用及机制

摘要

本文从以下几个方面进行论述： 第一部分 Gephyrin棕榈酰化在大鼠焦虑样行为中的作用 目的：桥蛋白（Gephyrin）是调节γ-氨基丁酸A型受体（γ-aminobutyric acid type A receptor， GABAAR）突触定位的关键性锚定蛋白，也是抑制性突触的重要骨架蛋白。由于和gephyrin相互作用的蛋白大多和多种神经精神疾病密切相关，gephyrin功能异常可能在癫痫、自闭症和精神分裂症等疾病的发生中也扮演了重要角色。棕榈酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，调控蛋白质的转运、定位及功能。近年来的研究发现gephyrin棕榈酰化修饰调节其和GABAAR的相互作用。鉴于受gephyrin调节的GABAAR功能与焦虑行为关系密切，我们推测gephyrin功能变化可能也参与了焦虑行为的产生。本实验采用多种焦虑模型和实验方法，进一步研究gephyrin棕榈酰化在大鼠焦虑样行为中的可能作用。 方法：利用高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）筛选高焦虑大鼠（high-anxiety，HA）和低焦虑（low-anxiety，LA）大鼠；采用慢性皮质酮暴露法建立应激相关焦虑模型；利用酰基-生物素交换（acyl-biotinyl exchange，ABE）法检测基底杏仁核（basolateral amygdala， BLA）全蛋白、GABAAR各亚基及gephyrin的棕榈酰化;通过EPM及旷场实验（open field test， OFT），检测N-叔丁基羟胺（N-(tert-Butyl) hydroxylamine，NtBuHA）对焦虑行为的影响，并通过电生理检测微小抑制性突触后电流（miniature inhibitorypostsynaptic potential currents，mIPSCs）和ABE法检测棕榈酰化研究其机制；检测干扰GABAAR与gephyrin间作用的GABAARα3 peptide对mIPSCs和焦虑行为的影响。 结果：（1）通过EPM筛选得到天然焦虑大鼠，根据在开放臂的运动时间将前40%的大鼠定义为LA鼠，后10%定义为HA鼠，中间比例为中等焦虑（intermediate-anxiety，IA）鼠。（2）通过ABE法发现较LA鼠，HA鼠BLA脑区全蛋白棕榈酰化水平显著降低；而GABAAR各亚基的表达及棕榈酰化修饰均未发生显著变化，但HA鼠gephyrin棕榈酰化修饰显著减少（LA：100.0±4.6%，HA：68.9±4.6%，n=5，P＜0.01）。（3）慢性皮质酮暴露显著增加大鼠焦虑样行为， ABE法检测结果表明慢性皮质酮减少大鼠BLA全蛋白棕榈酰化水平，同时降低gephyrin棕榈酰化修饰（Veh组：100.0±4.0%，Cort组：63.2±9.1%，n=6， P＜0.01）。（4）NtBuHA（1.0 mM）明显减少棕榈酰化修饰；BLA脑区给予NtBuHA后30 min，大鼠焦虑水平明显增加；全细胞膜片钳记录结果表明NtBuHA下调mIPSCs的幅度（Veh组：12.9±0.5 pA，NtBuHA组：10.4±0.6pA，n=16 cells from8 rats，P＜0.01）。Western blotting结果也证明NtBuHA减少gephyrin棕榈酰化修饰（Veh组：100.0±8.9%， NtBuHA组：66.2±5.9%，n=7，P＜0.01）。（5）干扰GABAAR与gephyrin之间作用的GABAARα3 peptide明显下调mIPSCs的幅度（Veh组：13.05±0.8pA，NtBuHA组：10.2±0.4pA，n=12-13 cells from10 rats，P＜0.01），通过抑制GABAAR各亚基与gephyrin间的相互作用而产生焦虑样行为。 结论：在天然焦虑模型及皮质酮暴露模型中，随着焦虑水平升高，蛋白质棕榈酰化修饰明显减少。使用NtBuHA减少BLA区gephyrin棕榈酰化修饰增加大鼠焦虑行为。同时，使用GABAARα3 peptide可明显干扰gephyrin与GABAAR各亚基之间的作用，提示gephyrin的棕榈酰化修饰是调节焦虑样行为的重要靶点。 第二部分 Gephyrin棕榈酰化在地西泮抗焦虑效应中的作用及机制 目的：苯二氮类药（benzodiazepines，BDZs）与GABAAR结合后，引发受体蛋白构象改变，促进GABA与GABAAR结合，使Cl-通道开放频率增加，从而加强GABA对神经系统的抑制效应。有研究表明gephyrin棕榈酰化修饰随抑制性神经元活性的升高而增加。结合gephyrin棕榈酰化在调节焦虑行为中的作用，本实验进一步探讨gephyrin棕榈酰化在地西泮（diazepam，DZP）抗焦虑行为中的作用及机制。 方法：定量-聚合酶链式反应（quantitativeploymersechain reaction，q-PCR）检测焦虑模型大鼠BLA脑区棕榈酰基转移酶的mRNA水平，通过Western blotting检测天然焦虑模型及皮质酮焦虑模型中gephyrin特异性的棕榈酰基转移酶DHHC12的表达水平；Western blotting检测DHHC12和gephyrin在大鼠各重要脑区的分布情况；腹腔注射DZP30 min后检测其对gephyrin棕榈酰化修饰及DHHC12活性的影响；利用慢病毒（lentic virus，LV）沉默BLA脑区的DHHC12，通过EPM及OFT观察沉默BLA区DHHC12对焦虑样行为和DZP抗焦虑效应的影响；利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）过表达BLA脑区DHHC12，结合腹腔注射氟马西尼（flumazenil，FMZ）观察过表达BLA脑区DHHC12对焦虑样行为的影响。 结果：（1）q-PCR检测发现，在天然焦虑大鼠模型中，DHHC12 mRNA水平在HA鼠的BLA区中明显低（LA组：100.0±4.4%，HA组：82.5±3.4%，n=8，P＜0.01）。（2）Western blotting检测发现gephyrin在mPFC表达最高，BLA脑区次之；DHHC12在BLA区表达最高。（3）腹腔注射DZP不仅显著升高BLA脑区的全蛋白棕榈酰化水平，而且上调gephyrin（Veh组：100.0±5.0%，DZP组：154.4±6.8%，n=6，P＜0.001）及DHHC12的棕榈酰化修饰水平（Veh组：100.0±13.4%，DZP组：157.7±14.9%，n=8，P＜0.01）。（4） LV-DHHC12明显下降 BLA脑区的 DHHC12（ LV-eGFP-shRNA组：100.0±6.6%， LV-DHHC12-shRNA组：55.0±10.1%，n=4，P＜0.05），腹腔给予DZP进行EPM及OFT检测，发现沉默BLA区DHHC12表达增加大鼠焦虑样行为，同时也取消DZP的抗焦虑作用。（5）通过AAV-DHHC12过表达DHHC12（AAV-eGFP组：100.0±9.1%，AAV-DHHC12组：310.1±46.3%，n=8，P＜0.001），腹腔给予FMZ检测EPM及OFT，表明在BLA区过表达DHHC12产生明显的抗焦虑作用，这种抗焦虑效应会被FMZ取消。 结论：Gephyrin棕榈酰化在DZP抗焦虑效应中发挥重要作用，其主要机制可能是DZP通过增加GABAAR活性，激活 DHHC12自身棕榈酰基转移酶活性的“乒乓机制”，进而增加底物gephyrin的棕榈酰化，最终增加GABAAR膜表达和突触后募集，参与其抗焦虑作用。

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