雷公藤红素诱导人肺腺癌A549细胞凋亡机制及与PI3K/Akt通路关系的研究

摘要

背景：肺癌是最常见的、对人体健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，发病率有逐年增高的趋势，发病年龄多在40岁以上，男女之比约为5:1。吸烟已被公认为肺癌的危险因素，其他的危险因素包括空气污染、结核、HPV等病毒感染、二氯甲醚和氯甲基甲醚、铬及铬酸盐、芥子气、焦油、煤的燃烧产物、矿物油和氯化乙烯、放射线等。肿瘤流行病学资料显示，肺癌总的五年生存率仅在14％左右，已经成为恶性肿瘤死亡原因的第一位；并且其发病率在多数国家呈现逐年持续上升趋势，然而其死亡率和预后却没有明显改观。
　　 肿瘤在发生发展演化的过程中受到诸多因素的影响和调控。人们已逐渐认识到肿瘤是一种机体内环境紊乱的疾病。细胞是组成人体内环境最基本的组成部分，它们不断地接受机体内环境和上下游的信号刺激，并对这些信号进行感应、整合和应答。PI3K/Akt通路的失调与非小细胞肺癌(NSCLC)的发生、发展、转移和预后密切相关，80％以上的非小细胞肺癌都存在Akt异常激活。
　　 雷公藤红素是我国传统中药雷公藤的单体之一，属三萜类色素，分子式为C29H38O4，分子量为450.61，具有广谱的抗肿瘤作用。近年来，许多国内外的研究都表明，雷公藤红素在体外能诱导对多种人源性肿瘤细胞发生凋亡，但其详尽的诱导凋亡机制尚未见报道。
　　 目的：
　　 1、雷公藤红素对人肺腺癌A549细胞增殖抑制的影响；
　　 2、雷公藤红素对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响；
　　 3、雷公藤红素引起人肺腺癌A549细胞凋亡的机制；
　　 4、雷公藤红素对人肺腺癌A549细胞PI3K/Akt信号通路的影响。
　　 材料和方法：
　　 1.MTT
　　 24孔细胞培养板中每孔接种1×106/ml的A549细胞，37℃，5％CO2条件下预培养。试验组加入终浓度分别为0.5μmol/L，1.0μmol/L，1.4μmol/L，1.6μmol/L，1.8μmol/L，2.0μmol/L，2.2μmol/L，2.4μmol/L，2.6μmol/L，3.0μmol/L，4.0μmol/L的雷公藤红素，实验中同时设置不加药物的对照组，37℃，5％CO2分别培养0h、36h、48h。所收集的细胞用PBS洗涤2次后重悬，调整细胞浓度为1×106/ml。MTT法测定雷公藤红素对A549细胞抑制率。
　　 2.细胞凋亡检测采用普通光镜、Hochest33258观察雷公藤红素处理A549细胞后发的形态学改变。采用Annexin V/PI流式细胞法观测细胞凋亡。取上述同一浓度雷公藤红素作用不同时间(0h、36h、48h)的A549细胞悬液100ul，分别加入AnnexinV、PI各5ul，将处理好的细胞上流式细胞仪检测。
　　 3.RT-PCR、Western Blot基因、蛋白检测实时荧光定量RT-PCR方法和免疫印迹方法分别检测2.2umol/L雷公藤红素作用0h、36h、48h后PI3K、Akt、Bcl-2、Bax基因和蛋白的变化。
　　 具体而言：
　　 RT-PCR：首先通过NCBI数据库进入GenBank数据库，由数据库提供的人BCL-2、BAX、PI3KCD、Akt2的基因序列，应用Primer Premier5.0引物软件设计PCR引物后合成引物。RT-PCR过程中先使用Trizol Reagent等试剂提取经雷公藤红素处理后的不同组别的A549细胞的RNA；再使用逆转录试剂盒完成RNA向cDNA的逆转录过程；最后将SYBR Green mix试剂盒、上下游引物、cDNA、ddH2O加入反应体系上机，使用SLAN全自动荧光定量PCR仪分析，绘制熔解曲线及扩增曲线，计数出CT值，从而得到扩增倍数。
　　 Western Blot：先用含cocktail的PMSF裂解液提取经雷公藤红素处理后不同组别的A549细胞总蛋白；SDS-PAGE电泳将待测样品中的蛋白质在凝胶中电泳后按分子量大小区分成不同条带；此后，将所需目的条带的蛋白质转移到PVDF膜上；使用用间接免疫酶标的方法化学发光、暗室显影。
　　 4.Caspase-3活性检测采用Caspase-3酶活性试剂盒检测。把试剂盒提供的pNA用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200 umol/L作为标准品后测定pNA标准曲线，得到标准曲线方程；将雷公藤红素作用后不同组别的A549细胞加入裂解液后测定Caspase-3的酶活性。
　　 结果：
　　 1.雷公藤红素可抑制非小细胞肺癌A549细胞生长，A549细胞经雷公藤红素处理后，细胞生长明显受抑制，增殖速度明显减弱，细胞逐渐由梭状变成椭圆形细胞，体积变小、胞质皱缩减少，细胞透明度下降，且可见到细胞中出现很多空泡状改变现象，部分细胞脱离贴壁状态，成为悬浮细胞，而正常的梭状细胞数却明显减少。且呈剂量和时间依赖性，其IC50值约为2.2umol/L。
　　 2.Hochest33258实验研究发现雷公藤红素可导致A549细胞凋亡，48h较36h更为明显；Annexin V/PI实验则应用流式细胞仪检测发现2.2umol/L雷公藤红素作用A549细胞36h、48h后，各组均观察到明显的细胞凋亡，与对照组比较差异显著。
　　 3.RT-PCR和Western Blot结果均表明雷公藤红素作用A549细胞36h、48h后，Bcl-2的基因及对应的蛋白表达水平下降，而Bax的相关基因和蛋白表达水平变化不明显，但由此以来Bax/Bcl-2比值增加，且随着时间的延长而增加。雷公藤红素作用A549细胞36h、48h后，PI3KCD及Akt2基因及与此对应的PI3K、p-Akt蛋白均较雷公藤红素作用前升高，且随作用时间延长而更明显。
　　 4.雷公藤红素可诱导A549细胞Caspase-3活性显著增高(P<0.05)，其作用强度随着药物时间延长而增强，呈时间依赖性。
　　 结论：
　　 1.雷公藤红素可抑制A549细胞生长，且随着药物浓度增高，雷公藤红素对A549细胞生长抑制作用逐渐明显。不同浓度的雷公藤红素分别作用36h、48h，其IC50值均接近2.2umol/L。
　　 2.雷公藤红素可诱导A549细胞的凋亡，且随作用时间延长，逐渐以晚期凋亡为主。
　　 3.雷公藤红素诱导A549细胞凋亡与Bcl-2家族相关，且雷公藤红素诱导A549细胞凋亡可能通过改变Bcl-2家族Bax/Bcl-2的比例最终影响线粒体的功能。
　　 4.雷公藤红素不能阻止PI3K/Akt信号转导途径，PI3K及Akt2基因、PI3K和p-Akt蛋白反而表达增高，这提示在雷公藤红素作用下，PI3K/Akt信号转导途径可能不直接诱导A549细胞凋亡。