固本健脑法对MCI大鼠学习记忆能力及海马Caveolin-1的影响

摘要

目的：从中医学对老年记忆的生理病理认识探讨老年人轻度认知障碍的发病机理为脾肾亏虚，脑失所养。遵循中医“虚则补之”“未病先防，既病防变”的治疗原则，提出固本健脑法治疗MCI。用东莨菪碱、NaNO2、40％乙醇腹腔注射制备学习记忆获得障碍、巩固障碍、再现障碍小鼠模型，观察固本健脑法对学习记忆获得障碍、巩固障碍、再现障碍模型小鼠学习记忆能力的影响，探讨固本健脑法对学习记忆获得、巩固、再现各反面障碍的治疗效果；用D-gal与NaNO2腹腔注射制备MCI大鼠模型，通过观察固本健脑法对MCI模型大鼠学习记忆能力、海马组织病理形态、Cav-1、Syn、SNAP-25表达等相关指标的影响，探讨固本健脑法对MCI模型大鼠的治疗作用机理，为中医药治疗中老年人轻度认知障碍提供理论和实验依据。
　　 方法：
　　 1.将3月龄昆明种小鼠90只，随机分成3组，每组又分为3个亚组，即正常组(A组)30只，其中A1、A2、A3每组各10只；固本健脑液组(B组)30只，其中B1、B2、B3每组各10只；模型组(C组)30只，其中C1、C2、C3各10只。适应性喂养一周后，各组小鼠均每日1次按10ml/kg·d-1的剂量灌胃，正常组和模型组小鼠灌服0.9％的生理盐水，固本健脑液组则灌服含生药1g/ml的固本健脑液。10天后B1、C1组腹腔注射东莨菪碱制备记忆获得障碍模型，B2、C2组腹腔注射亚硝酸钠制备记忆巩固障碍模型，B3、C3组腹腔注射40％乙醇制备记忆再现障碍模型，A1、A2、A3组腹腔注射等容量生理盐水，用跳台法实验观察实验小鼠的学习记忆能力。
　　 2.将用Morris水迷宫法筛选出记忆能力相当的84只3月龄SD大鼠随机分为6组，即正常组、模型组、脑复康治疗组(简称脑康组)、固本健脑液低剂量组(简称固低组)、固本健脑液中剂量组(简称固中组)、固本健脑液高剂量组(简称固高组)，每组14只。各组大鼠适应性喂养一周后，每日上午正常组大鼠腹腔注射生理盐水，固高组、固中组、固低组、脑康组、模型组大鼠腹腔注射D-gal和NaNO2，连续40天以复制MCI模型，从造模13天起每日下午加以正常组、模型组大鼠灌服生理盐水，固高组、固中组、固低组、脑康组大鼠分别灌服相应药物进行预防，连续28天。40天后用水迷宫行为学试验观察各组大鼠学习记忆能力，光镜、电镜下观察各组大鼠海马组织病理形态学改变，免疫组化法检测各组大鼠海马组织Cav-1的表达，实时荧光定量PCR方法检测各组大鼠海马组织Cav-1、SNAP-25的表达，免疫印迹法检测各组大鼠血清Cav-1、Syn的表达。
　　 结果：
　　 1.与学习记忆获得障碍、巩固障碍、再现障碍模型各组小鼠相比较，正常组潜伏期明显高于各模型组(P<0.01)、5分钟内错误次数明显低于各模型组(P<0.01)；固本健脑液治疗组潜伏期高于各模型组(P<0.05)、5分钟内错误次数低于各模型组(P<0.05)。
　　 2.与正常组相比，固高组、固中组、固低组、脑康组、模型组大鼠精神倦怠，均不同程度的表现出饮水量、进食量、活动量减少，皮毛干枯、稀疏、脱落。
　　 3.Morris水迷宫行为学实验，定位航行实验中各组大鼠的平均潜伏期、平台所在象限百分比，空间探索实验中各组大鼠的平均潜伏期、跨越原平台位置的次数、平台所在象限百分比的结果，正常组、固高组、固中组与模型组比较均有显著性差异(P<0.01)，固低组、脑康组与模型组比较均有差异(P<0.05)，固高组、固中组与脑康组比较均有差异(P<0.05)，固低组与脑康组比较没有统计学意义(P>0.05)。
　　 4.光镜、电镜病理形态上观察，正常组主要表现为海马神经元细胞饱满，细胞层数及细胞数目较多，大小一致，排列紧密、整齐，胞膜完整，突触结构丰富；模型组大鼠海马神经细胞数目明显减少，细胞排列混乱，层数减少甚至单层，胞膜、核膜界限不清，胞核空泡变性，核仁变小、裂解，胞质增多，突触数目明显减少；各治疗组介于正常组和模型组之间，与模型组相比均有不同程度的改善，以固高组、固中组的改善最为显著。
　　 5.免疫组化检测各组大鼠海马组织Cav-1蛋白的表达，结果正常组大鼠海马内Cav-1蛋白阳性免疫产物表现最多，模型组最少，各治疗组介于正常和模型组之间，与模型组相比均有不同程度的改善，以固高组、固中组的改善最为显著。
　　 6.实时荧光定量PCR方法检测各组大鼠海马组织Cav-1、SNAP-25的表达，结果二者在各组大鼠海马内的表达具有高度的正相关性。正常组大鼠海马内Cav-1、SNAP-25的表达明显高于模型组(P<0.01)；各治疗组大鼠海马内Cav-1、SNAP-25的表达介于正常组和模型组之间，与模型组比较均有显著性差异(P<0.01)；固高组、固中组与脑康组大鼠海马内Cav-1、SNAP-25的表达比较均有差异(P<0.05)，固低组与脑康组比较没有统计学意义(P>0.05)。
　　 7.免疫印迹法检测各组大鼠血清Cav-1、Syn的表达，结果二者在各组大鼠海马内的表达显示出高度的正相关性。正常组大鼠海马内Cav-1、Syn的表达明显优于模型组(P<0.01)；各治疗组大鼠海马内Cav-1、Syn的表达介于正常组和模型组之间，与模型组比较均有明显提高(P<0.01)；固高组、固中组大鼠海马内Cav-1、Syn的表达高于脑康组(P<0.05)，固低组与脑康组大鼠海马内Cav-1、Syn的表达比较没有统计学意义(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1.脾肾亏虚，脑失所养是轻度认知障碍的基本病机，固本健脑法是防治MCI的有效可行方法。
　　 2.固本健脑法能明显改善学习记忆获得、巩固、再现障碍模型大鼠学习记忆能力。
　　 3.联合使用D-gal和NaNO2腹腔注射，可以较好地复制MCI模型，重复性高。
　　 4.固本健脑法能有效改善MCI模型大鼠学习记忆能力；减轻MCI模型大鼠病理形态学的改变；提高MCI模型大鼠海马组织内Cav-1、Syn、SNAP-25的表达。
　　 5.固本健脑法可能是通过作用于Cav-1蛋白，提高突触前Syn、SNAP-25蛋白表达水平，调节海马神经可塑性，从而改善年龄相关性神经可塑性下降而发挥神经保护作用，提高学习记忆能力延缓衰老。