逍遥散对雷公藤致大鼠肝毒性的保护作用及其机制研究

摘要

雷公藤系卫矛科雷公藤属一年生藤本植物,性辛、凉,味苦,归肝、肾经,具有祛风除湿,活血通络,消肿止痛,杀虫解毒等功效。该药对类风湿性关节炎、慢性肾炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病具有很好的治疗效果。但雷公藤有大毒,其所致肝毒性在相关文献报道中居单味肝毒性中药的首位,很大程度上限制了其在临床上推广应用。但有关雷公藤致肝毒性的病因和发病机制尚不完全清楚。所以,本课题在用雷公藤建立大鼠急性肝毒性模型的基础上,运用现代分子生物学技术,探索雷公藤导致肝毒性的分子机制,并观察中医方剂逍遥散对雷公藤致大鼠肝毒性的保护作用及其作用机制,以此为逍遥散防治雷公藤所致肝毒性提供理论和实验依据。
　　 实验一、雷公藤致大鼠急性肝毒性模型的制备
　　 目的:建立雷公藤水煎剂致大鼠急性肝毒性模型。
　　 方法:分别设低、中、高给药剂量(2.5、3.75、5.0 g.kg-1)和不同给药时间(1、2、3、4、5、6d),大鼠经口灌服雷公藤水煎剂,同时设正常对照组。采用称重法测定大鼠肝脏指数,干化学法检测血清ALT、AST活力,HE染色观察肝组织病理改变并进行半定量分析。
　　 结果:与正常组比较,雷公藤水煎剂中、高剂量组大鼠的肝脏指数及血清ALT、AST的活力显著升高,且肝组织均有明显病理改变,肝脏严重受损,差异均有统计学意义;随着给药时间的延长,雷公藤水煎剂的毒性呈加重趋势,干预4d后达到峰值。
　　 结论:雷公藤中剂量(3.75g·kg-1)干预4d可作为制备大鼠急性肝毒性模型的相对合适剂量和时间。
　　 实验二、逍遥散对雷公藤致大鼠急性肝毒性的保护作用
　　 目的:观察不同剂量和不同给药方案的逍遥散对雷公藤水煎剂致大鼠急性肝毒性的保护作用。
　　 方法:不同剂量实验分组:大鼠经口灌服低、中、高剂量(3.375、6.75、13.5 g·kg-1)的逍遥散进行预防性干预,每天1次,连续4d,从第5d开始经口灌服造模剂量的雷公藤水煎剂,每天1次,连续4d,同时设正常对照组、模型组和甘利欣阳性对照组。不同给药方案实验分组:分别在造模剂量的雷公藤水煎剂给药4d前、同时、4d后(预防、对抗和治疗)经口灌服大鼠逍遥散(6.75 g·kg-1)进行干预,每天1次,连续4d,同时设正常对照组和模型组。采用称重法测定大鼠肝脏指数,干化学法检测血清ALT、AST活力,HE染色观察肝组织病理改变并进行半定量分析。
　　 结果:与模型组比较,逍遥散中、高剂量组大鼠的肝脏指数及血清ALT、AST活力明显降低,肝脏病理损伤明显减轻,差异均有统计学意义,与正常组和甘利欣组比较,差异均无统计学意义。与模型组比较,逍遥散预防组大鼠肝脏指数及血清ALT、AST的活力明显降低,大鼠肝脏病理损伤明显减轻,差异均有统计学意义,与正常组比较,差异均无统计学意义。
　　 结论:逍遥散中剂量(6.75 g·kg-1)可作为其保护雷公藤致大鼠急性肝毒性的相对合适剂量,且预防作用效果最好。
　　 实验三、雷公藤致大鼠急性肝毒性及逍遥散对其保护作用的机制研究
　　 目的:探讨雷公藤水煎剂致大鼠急性肝毒性及逍遥散对其保护作用的分子机制。
　　 方法:分别在造模剂量的雷公藤水煎剂给药4d前经口灌服大鼠逍遥散(6.75 g·kg-1),腹腔注射CYP450诱导剂苯巴比妥(100mg·kg-1)和CYP450抑制剂酮康唑(80mg·kg-1),每天1次,连续4d,同时设正常对照组和模型组。采用称重法测定大鼠肝脏指数,干化学法检测血清ALT、AST活力,HE染色观察肝组织病理改变并进行半定量分析;CO还原分光光度法测定肝微粒体CYP450含量,化学比色法测定b5含量;Westem-immunobloting检测肝微粒体cYP3A4、CYP2C19、肝线粒体、胞质Cyt-C蛋白水平;HPLc检测肝微粒体CYP3A4、CYP2C19的活性;Real-Time PCR检测肝组织中Bcl-2,Bax、Caspase-3的mRNA水平;免疫组织化学法检测肝组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白水平;流式细胞术检测肝细胞线粒体膜电位水平;TUNEL法检测肝细胞的凋亡率;化学比色法检测血清SOD、GSH-Px活力及MDA含量;ELISA法检测大鼠血清CD68、TNF-α的含量.
　　 结果:
　　 (1)雷公藤致大鼠急性肝毒性及逍遥散对其行使保护作用时肝脏CYP450、b5、CYP3A4及CYP2C19的变化
　　 与正常组比较,模型组大鼠肝脏CYP450、b5含量明显降低(P＜0.05或P＜0.01),CYP3A4、CYP2C19蛋白水平和活性均明显降低(P＜0.05或P＜0.01);
　　 与模型组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠肝脏CYP450含量明显升高(P＜0.01),b5含量有升高趋势(P＞0.05),CYP3A4、CYP2C19蛋白水平和活性均明显升高(P＜0.05或P＜0.01),CYP450抑制组大鼠CYP450含量明显降低(P＜0.05),b5含量有降低趋势(P＞0.05),CYP3A4、CYP2C19蛋白水平和活性均明显降低(P＜0.05);
　　 与正常组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠肝脏CYP450含量明显升高(P＜0.01),b5含量有降低趋势(P＞0.05);
　　 逍遥散预防组与CYP450诱导组比较,大鼠肝脏CYP450、b5含量差异不明显(P＞0.05)。
　　 (2)逍遥散通过诱导大鼠肝脏CYP450及其亚酶CYP3A4、CYP2C19而对雷公藤致大鼠急性肝毒性的影响
　　 与正常组比较,模型组大鼠的肝脏指数及血清ALT、AST的活力明显升高(P＜0.01),肝组织有明显病理改变(P＜0.05);
　　 与模型组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠肝脏指数及血清ALT、AST的活力明显降低(P＜0.05或P＜0.01),肝组织病理改变明显减轻(P＜0.05),CYP450抑制组大鼠的肝脏指数及血清ALT、AST的活力明显升高(P＜0.05),肝组织病理改变明显加重(P＜0.05);
　　 与正常组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠的肝脏指数及血清ALT、AST的活力差异不明显(P＞0.05),肝组织无明显病理改变;
　　 与CYP450诱导组比较,逍遥散预防组大鼠的肝脏指数及血清ALT、AST的活力有降低趋势(P＞0.05),肝组织病变程度更轻(P＜0.05)。
　　 (3)逍遥散通过诱导大鼠肝脏CYP450及其亚酶CYP3A4、CYP2C19而对雷公藤致大鼠肝细胞过度凋亡的影响
　　 与正常组比较,模型组大鼠肝脏Bcl-2 mRNA水平明显降低,Bax、Caspase-3 mRNA水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01),Bcl-2蛋白水平明显降低,Bax、Caspase-3蛋白水平明显升高(P＜0.01),肝细胞线粒体膜电位水平明显降低(P＜0.01),肝线粒体内Cyt-C水平明显降低,胞质内Cyt-C水平明显升高(P＜0.01),肝细胞凋亡率明显升高(P＜0.01);
　　 与模型组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠肝脏Bcl-2 mRNA水平明显升高,Bax、Caspase-3 mRNA水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01),Bcl-2蛋白水平明显升高,Bax、Caspase.3蛋白水平明显降低(P＜0.01),肝细胞线粒体膜电位水平明显升高(P＜0.01),肝线粒体内Cyt-C水平明显升高,胞质内Cyt.C水平明显降低(P＜0.01),肝细胞凋亡率明显降低(P＜0.01),CYP450抑制组大鼠肝脏Bcl-2 mRNA水平明显降低,Bax、Caspase-3 mRNA水平明显升高(P＜0.05),Bcl-2蛋白水平明显降低,Bax、Caspase-3蛋白水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01),肝细胞线粒体膜电位水平明显降低(P＜0.05),肝线粒体内Cyt-C水平明显降低,胞质内Cyt-C水平明显升高(P＜0.05),肝细胞凋亡率明显升高(P＜0.05);
　　 与正常组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠肝脏Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA水平差异不明显(P＞0.05),Bcl-2、Bax蛋白水平差异不明显(P＞0.05),肝细胞线粒体膜电位水平差异不明显(P＞0.05),肝线粒体内、胞质内Cyt-C水平差异不明显(P＞0.05),逍遥散预防组大鼠肝脏Caspase-3蛋白水平及肝细胞凋亡率差异不明显(P＞0.05),CYP450诱导组大鼠肝脏Caspase-3蛋白水平及肝细胞凋亡率明显升高(P＜0.05);
　　 与CYP450诱导组比较,逍遥散预防组大鼠肝脏Bcl-2 mRNA水平有升高趋势,Bax、Caspase-3 mRNA水平有降低趋势(P＞0.05),Bcl-2蛋白水平明显升高(P＜0.05),Bax、Caspase-3蛋白水平有降低趋势(P＞0.05),肝细胞线粒体膜电位水平明显升高(P＜0.05),肝线粒体内Cyt-C水平明显升高,胞质内Cyt-C水平明显降低(P＜0.05),肝细胞凋亡率有降低趋势(P＞0.05)。
　　 (4)逍遥散通过诱导大鼠肝脏CYP450及其亚酶CYP3A4、CYP2C19而对雷公藤致急性肝毒性大鼠血清SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影响
　　 与正常组比较,模型组大鼠血清SOD、GSH-Px活力明显降低,MDA含量明显升高(P＜0.01);
　　 与模型组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠血清SOD、GSH-Px活力明显升高,MDA含量明显降低(P＜0.01),CYP450抑制组大鼠血清SOD、GSH-Px活力明显降低,MDA含量明显升高(P＜0.05);
　　 与正常组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠血清SOD、GSH-Px活力及MDA含量差异不明显(P＞0.05);
　　 与CYP450诱导组比较,逍遥散预防组大鼠血清SOD、GSH-Px活力有升高趋势,MDA含量有降低趋势(P＞0.05)。
　　 (5)逍遥散通过诱导大鼠肝脏CYP450及其亚酶CYP3A4、CYP2C19而对雷公藤致急性肝毒性大鼠血清CD68、TNF-α的含量的影响
　　 与正常组比较,模型组大鼠血清CD68、TNF-α的含量明显升高(P＜0.05);
　　 与模型组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠血清CD68、TNF-α的含量明显降低(P＜0.05或P＜0.01),CYP450抑制组大鼠血清CD68、TNF-α的含量明显升高(P＜0.05);
　　 与正常组比较,逍遥散预防组、CYP450诱导组大鼠血清CD68、TNF-α的含量差异不明显(P＞0.05);
　　 与CYP450诱导组比较,逍遥散预防组大鼠血清CD68、TNF-α的含量有降低趋势(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 (1)雷公藤致肝毒性的机制:雷公藤在代谢的同时抑制了CYP450酶含量及其亚酶CYP3A4和CYP2C19的含量和活性,导致自身代谢减慢,毒性增强,进而引起下游损伤途径,最终导致肝毒性的发生。具体机制表现在以下三个方面:
　　 1)Bcl-2的基因和蛋白表达水平下调,Bax、Caspase-3的基因和蛋白表达水平上调,引起线粒体膜电位水平下降,Cyt-C释放增加,导致肝细胞过度凋亡。
　　 2)SOD、GSH-Px活力下降,MDA含量增加,导致脂质过氧化反应性肝损伤。
　　 3)CD68、TNF-α的含量增加,导致免疫性肝损伤。
　　 (2)逍遥散保护雷公藤致肝毒性的机制:通过诱导CYP450酶含量及其亚酶CYP3A4和CYP2C19的含量和活性,提高CYP450酶对雷公藤的代谢解毒能力,进而抑制了下游损伤途径,保护肝脏。具体机制表现在以下三个方面:
　　 1)Bcl-2的基因和蛋白表达水平上调,Bax、Caspase-3的基因和蛋白表达水平下调,引起线粒体膜电位水平升高,Cyt-C释放减少,抑制了肝细胞过度凋亡。
　　 2)SOD、GsH-Px活力升高,MDA含量减少,抑制了脂质过氧化反应性肝损伤。
　　 3)CD68、TNF-α的含量减少,抑制了免疫性肝损伤。