参杖颗粒调控Rho/Rho激酶途径对肝星状细胞活化影响的研究

摘要

目的:本课题研究依据温病学“伏气学说”及络病学“毒伏肝络”理论，组方参杖颗粒，功效益气养阴、清热化湿解毒、活血通络。在前期研究揭示该方抗肝纤维化机制与调控肝星状细胞(Hepatic stellatecell，HSC)活化相关的基础之上，探讨参杖颗粒对Rho/Rho激酶途径的上游激活、中间传导及下游效应的调节作用，以明确该药抗肝纤维化作用的新靶点，为揭示其抗纤维化的机制提供新的实验依据。 方法:①运用血清药理学方法制备不同浓度的参杖颗粒含药血清（对大鼠的给药剂量等同于临床剂量的5倍、10倍和20倍）及正常血清分组培养HSC，并利用流式细胞术检测HSC细胞周期、利用RT-PCR检测a-SMAmRNA、利用细胞迁移实验检测细胞迁移能力。最终筛选出最佳的用于实验研究的参杖颗粒含药血清浓度。 ②根据实验一筛选出的最佳实验浓度参杖颗粒含药血清干预培养HSC，应用Rho/Rho激酶途径的激动剂溶血磷脂酸(Lysophosphatidic Acid，LPA)及抑制剂Y-27632作为工具要，分别设立正常对照组(C)、激活对照组(CL)、抑制对照组(CY)、药物血清处理组(T)、激活后药物处理组(TL)，运用荧光免疫检测各组HSC中a-SMA蛋白的表达;运用流式细胞术检测各组HSC细胞周期;应用细胞迁移实验测定各组HSC的迁移能力。 ③在实验二的基础之上，进一步利用Elisa试剂盒检测参杖颗粒含药血清处理前后各组HSC分泌ET-1、TGF-β1的表达水平。 ④在实验二的基础之上，应用免疫印迹法检测参杖颗粒含药血清处理前后p160ROCK（Rho的靶蛋白）磷酸化水平，应用免疫沉淀检测含药血清处理前后RhoGTP活化水平。 结果:①细胞周期检测结果显示细胞明显被阻滞于G2期，以10×浓度组抑制细胞增殖的效果最明显，与正常对照组相比有显著统计学意义(P＜0.01); RT-PCR结果显示a-SMA mRNA水平在10×浓度组血清处理的HSC中最低，与正常对照组相比有显著统计学意义(P＜0.01);细胞迁移实验显示10×浓度组血清处理对HSC迁移能力抑制最明显，与正常对照组相比有显著统计学意义(P＜0.01)。 ②荧光免疫结果显示正常静息状态下HSC表达α-SMA较少（C组），LPA作用于HSC后(CL组)导致α-SMA的表达增加，抑制剂Y-27632（CY组）则导致α-SMA表达下降，参杖颗粒含药血清处理静息HSC后（T组）α-SMA的表达更少，预先被LPA活化HSC加入含药血清处理后（TL组）HSC中α-SMA的表达被抑制，荧光密度分析T组较C组荧光密度下降明显(P＜0.05)，TL组较CL组荧光密度显著下降(P＜0.01);细胞周期检测结果显示T组、TL组细胞明显被阻滞于G2期，T组与正常对照组相比有显著统计学意义(P＜0.05)，TL组较CL组相比有显著统计学意义(P＜0.01);细胞迁移实验显示T组、TL组细胞迁移能力明显被抑制，与正常对照组相比有显著统计学意义(P＜0.05)，TL组与CL组比较有显著性差异(P＜0.01)。 ③Elisa检测显示T组、TL组细胞分泌ET-1、TGF-β1明显减少，T组与正常对照组相比有显著统计学差异(P＜0.01)，而TL组与CL组比较有显著性差异(P＜0.01)。 ④免疫沉淀实验结果显示T组、TL组细胞中Rho-GTP的活化水平明显降低，含药血清处理的T组中Rho活化水平几乎完全被抑制，与C组比较具有显著差异(P＜0.05); TL组与CL组比较，Rho的活化水平被显著抑制，差异具有统计学意义(P＜0.01)。免疫印迹T组、TL组细胞中p160ROCK磷酸化水平显著被抑制，其中T组与C组相比有统计学差异(P＜0.05)，TL组与CL组比较有显著性差异(P＜0.01)。 结论:①参杖颗粒制备成5.25g/ml溶液，按1ml/100g的剂量给大鼠灌胃后所制备的含药血清具有最佳的抑制HSC活化的作用，因而被确定为最符合本实验要求的参杖颗粒含药血清浓度。 ②参杖颗粒通过减少HSC合成α-SMA蛋白、抑制HSC分泌ET-1和TGF-β1、抑制HSC增殖和迁移，从而抑制HSC的活化;参杖颗粒对HSC在合成、增殖、收缩、迁移、分泌等方面的抑制性调节作用是其发挥抗肝纤维化作用的可能机制。 ③参杖颗粒可以抑制活化的HSC中RhoGTP的活化水平及p160ROCK的磷酸化水平;参杖颗粒能够通过抑制Rho/Rho激酶途径，从而抑制HSC的增殖、收缩、迁移、分泌及活化;Rho/Rho激酶途径是参杖颗粒抗肝纤维化作用的重要细胞转导途径。

目录

声明

摘要

英文缩略词对照表

前言

实验一 不同浓度参杖颗粒含药血清对HSC活化、增殖、迁移的调节

1 材料与方法

2 结果与分析

实验二 参杖颗粒对HSC活化、增殖、迁移的抑制作用及机制研究

1 材料与方法

2 结果与分析

实验三 参杖颗粒对HSC分泌TGF-β 1、ET-1的抑制作用及机制研究

1 材料与方法

2 结果与分析

实验四 参杖颗粒对Rho／Rho激酶途径的调节作用

1 材料与方法

2 结果与分析

讨论与总结

1 中医理论探讨

2 研究思路

3 参杖颗粒立方依据

4 参杖颗粒的血清药理学方法

5 检测指标及意义

6 肝纤维化与Rho／Rho激酶途径

7 结果讨论

8 创新点

结语

参考文献

附录 文献综述 中药抗肝纤维化的实验方法学研究进展

发表论文及科研实践

致谢