益气化痰祛瘀方介导NO-cGMP-KATP途径对COPD肺血管舒张作用的机制研究

摘要

1、目的：
　　在中医理论指导下，探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)发生发展的病机演变，并以NO-cGMP-KATP途径为切入点，分别从离体血管、动物水平和细胞水平观察益气化痰祛瘀方—芪白平肺胶囊对 COPD肺血管的舒张作用，探讨COPD发生发展过程中，NO/cGMP通路与KATP通道的相关性，探究益气化痰祛瘀方—芪白平肺胶囊防治COPD肺动脉高压的分子机制，为防治COPD肺动脉高压提供依据。
　　2、方法：
　　2.1离体肺动脉环实验研究
　　分离第3～4级肺动脉用于制备离体大鼠肺动脉环，采用四通道离体微血管张力测定系统依次观察益气化痰祛瘀方—芪白平肺胶囊在不同浓度(0.125 g/Kg,0.25 g/Kg,0.5 g/Kg,1 g/Kg,2 g/Kg)对收缩剂U46619诱导的肺血管收缩效应的影响。并观察在不同阻断剂L-NAME、ODQ、GLYB预孵育下，对芪白平肺胶囊舒张作用的影响。
　　2.2动物实验研究
　　SPF级大鼠随机分为6组：正常组、模型组、芪白平肺高剂量组、芪白平肺中剂量组、芪白平肺低剂量组和尼可地尔对照组，每组20只。采用复合因素复制 COPD痰瘀阻肺证大鼠模型，造模结束后，观察大鼠宏观体征、肺功能、血流动力学检测、Masson染色病理形态学变化，评价模型建立及其对COPD痰瘀阻肺证大鼠的影响，Elisa测定大鼠血清一氧化氮(NO)、环鸟苷酸(cGMP)浓度变化，免疫组化检测内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达，分别采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹技术(Western Blot)检测KATP通道Kir6.1和SUR2B mRNA和蛋白的表达。
　　2.3细胞实验研究
　　SPF级大鼠给予芪白平肺胶囊颗粒连续灌胃10日，制备芪白平肺含药血清。采用组织块贴壁法，体外培养原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)；MTT法检测低氧条件下QBPF对PASMCs增值的影响，筛选出最佳反应时间；RT-qPCR检测PASMCs内Kir6.1和SUR2B基因 mRNA水平，Western blot不同低氧时间下Kir6.1和SUR2B的表达，以及芪白平肺含药血清对其表达的影响。
　　3、结果：
　　3.1离体肺动脉环实验研究
　　3.1.1芪白平肺胶囊对正常大鼠肺动脉环舒张作用的影响
　　芪白平肺胶囊对U46619诱导的内皮完整的正常大鼠肺动脉环收缩具有一定的舒张作用，并呈一定的浓度依赖关系，半数有效浓度(EC50)为0.56g/L，最大舒张率为84.30±6.27％(P<0.01)。与内皮完整的肺动脉环相比，内皮剥夺后的肺动脉收缩作用，以及芪白平肺胶囊对肺动脉环的舒张作用均显著减弱，EC50为1.33g/L，最大舒张率为47.91±4.09%(P<0.01)。
　　3.1.2 L-NAME、ODQ对芪白平肺胶囊舒张大鼠肺动脉环作用的影响
　　L-NAME预孵育组的最大舒张率为45.81±8.72%，ODQ预孵育组的最大舒张率为50.42±7.5%，与正常大鼠内皮完整组的血管舒张率相比，具有显著差异(P<0.01)，与内皮剥夺组相比无显著性差异(P>0.05)。
　　3.1.3 GLYB对芪白平肺胶囊舒张大鼠肺动脉环作用的影响
　　GLYB能部分阻断由芪白平肺胶囊介导的肺动脉环舒张(P<0.01, Emax:84.30±6.27 in control，51.34±9.58% in GLYB-QBPF)。
　　3.1.4芪白平肺胶囊对COPD痰瘀阻肺证大鼠肺动脉环张力的影响
　　痰瘀阻肺证大鼠对U446619诱导的肺动脉的血管收缩能力，以及芪白平肺胶囊对COPD痰瘀阻肺证大鼠肺动脉环的舒张作用，均显著减弱(P<0.01)。与正常大鼠（Emax=84.30±6.27%，EC50=0.72g/L）相比，芪白平肺胶囊诱导的肺动脉环最大舒张率下降22.22%，最大舒张率为62.63%±10.02，EC50为0.72g/L。
　　3.2动物实验研究
　　3.2.1宏观体征观察
　　模型组大鼠的反应较正常组迟缓，精神萎靡，常拱背蜷卧，皮毛不华，饮水进食减少，体重增幅减少甚至不增加，伴有咳嗽、喷嚏，呼吸急促，口鼻分泌物增多，可闻及气道痰鸣音，随着低氧进程，可观察到鼻部、唇周及爪甲紫绀，符合 COPD痰瘀阻肺证的相关表现。芪白平肺胶囊各剂量组和尼可地尔组相关症状得到不同程度的改善。正常组未见明显异常。3.2.2芪白平肺胶囊对大鼠肺功能参数的影响
　　与正常组大鼠相比，模型组大鼠的FEV0.3， FVC和FEV0.3/FVC的肺功能参数值显著下降(P<0.01)，芪白平肺胶囊高、中、低剂量组和尼可地尔组的肺功能参数值均有不同程度的改善(P<0.01)。
　　3.2.3芪白平肺胶囊对大鼠血气的影响
　　与正常组相比，模型组大鼠的pH、动脉PaO2、SaO2的值显著性降低(P<0.01)，而动脉PaCO2的值显著性升高(P<0.01)。给予不同剂量芪白平肺胶囊治疗后，其pH、动脉PaO2的值与模型组相比，均有不同程度上升，而动脉PaCO2的值显著性显著性降低(P<0.05，或P<0.01)。
　　3.2.4芪白平肺胶囊对大鼠右心室收缩压、平均肺动脉压及心室肥厚度的影响
　　与正常组相比，模型组大鼠的RVSP、mPAP和RV/(LV+S)均有显著性升高(P<0.01)。给予不同剂量芪白平肺胶囊治疗后，其RVSP、mPAP和RV/(LV+S)均有不同程度的降低(P<0.05，或P<0.01)。
　　3.2.5芪白平肺胶囊对大鼠肺小动脉形态学影响
　　结果表明，与正常对照组相比，模型组大鼠的肺小动脉显著增厚，中膜红色的肌纤维明显增生，外膜的蓝色胶原纤维增生，血管周围和组织间隙有大量炎性细胞浸润。而不同剂量芪白平肺和阳性对照尼可地尔可不同抑制抑制肺血管肌纤维和胶原纤维增生。
　　3.2.6芪白平肺胶囊对大鼠血清NO、cGMP含量的影响
　　与正常组相比，模型组大鼠的NO和cGMP显著性下调(P<0.01)，而芪白平肺高剂量组、中剂量组和尼可地尔组的NO含量和芪白平肺高剂量组、中剂量组、低剂量组和尼可地尔组的cGMP含量升高(P<0.05或P<0.01)。
　　3.2.7芪白平肺胶囊对大鼠肺动脉eNOS、iNOS表达的影响
　　正常组大鼠肺血管内皮eNOS强阳性表达，平滑肌iNOS弱阳性表达，芪白平肺胶囊高、中、低剂量和尼可地尔能不同程度上调eNOS，下调iNOS的相对表达(P<0.05，或P<0.01)。
　　3.2.8芪白平肺胶囊对大鼠Kir6.1、 SUR2B基因 mRNA表达的影响
　　结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织的Kir6.1 mRNA和SUR2B mRNA呈现显著的下降(P<0.01)，与模型组相比，芪白平肺胶囊高、中、低剂量组和尼可地尔组分别经过药物干预后，能提升Kir6.1 mRNA和SUR2B mRNA水平的表达(P<0.05或P<0.01)。
　　3.2.9芪白平肺胶囊对大鼠KIR6.1、 SUR2B蛋白表达的影响
　　为了深入研究芪白平肺胶囊对KATP通道的调控作用，各组大鼠肺组织KIR6.1和 SUR2B蛋白表达被检测。结果表明，与正常组相比，模型组SUR2B蛋白的表达显著下调，而芪白平肺胶囊不同剂量和尼可地尔能显著上调其表达( P<0.01，或P<0.05)，KIR6.1蛋白上调和下调的趋势不显著(P>0.05)
　　3.3细胞实验研究
　　3.3.1大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的形态学特征
　　原代大鼠肺动脉平滑肌组织块贴壁第3～5天可见贴壁附近有少量不规则长梭形细胞爬出，后呈放射性生长，约7～10天成束的细胞平行排列，部分区域细胞呈多层重叠，部分区域呈单层，高低起伏，呈现平滑肌细胞特征性的“峰-谷”状致密分布。激光扫描共聚焦显微镜下，观察到胞质中有较强的呈丝状分布的绿色荧光，为平滑肌α-肌动蛋白，细胞核呈长杆形或卵圆形蓝色荧光。
　　3.3.2不同时间点各浓度HYXQ对大鼠PASCMs增殖的影响
　　MTT结果表明，与常氧组相比，低氧12h、24h、48h、72h，OD值均显著增加，PASCMs出现增殖，(P<0.01)，各时间点，5%、10%、20%浓度HYXQ能不同程度抑制低氧诱导的PASCMs增殖，OD值显著降低(P<0.05或P<0.01)。其抑制作用以低氧24h的20%QBPF组最显著。
　　3.3.3不同时间低氧对PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达的影响
　　结果表明：与各低氧组相比，常氧状态下(即低氧0h组)，PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达维持在较低水平(P<0.01)，随着低氧时间延长，低氧6h和低氧12h的Kir6.1和SUR2B蛋白表达开始上升，代表KATP通道开放，蛋白表达在低氧24h达到高峰(P<0.01)，随着低氧时间延长，低氧48h、72h的蛋白表达出现不同程度下调(P<0.05或P<0.01)。
　　3.4 HYXQ对PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达的影响
　　结果表明，与常氧组相比，低氧组、20% HYXQ组和10% HYXQ组和5%HYXQ组 PASMCs中 Kir6.1和 SUR2B蛋白的表达均显著增加(P<0.01)，且20% HYXQ组和10% HYXQ组PASMCs中的Kir6.1和SUR2B蛋白表达高于低氧组(P<0.05或P<0.01)。
　　3.5 GLYB对HYXQ干预PASMCsKir6.1和SUR2B蛋白表达的影响
　　结果表明，与常氧组相比，低氧组、20% HYXQ组PASMCs的Kir6.1和SUR2B蛋白的表达均显著增加(P<0.01)，而不同浓度GLYB干预后，高剂量GLYB和中剂量GLYB组能显著下调甚至阻断Kir6.1和SUR2B蛋白的表达水平(P<0.01)。
　　3.6 L-NAME对HYXQ干预PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达的影响
　　结果表明，与常氧组相比，低氧组、20% HYXQ组PASMCs的Kir6.1和SUR2B蛋白的表达均显著增加( P<0.01)，而不同浓度L-NAME干预后，高剂量L-NAME和中剂量L-NAME组能显著下调Kir6.1和SUR2B蛋白的表达水平(P<0.05或P<0.01)。
　　4、结论：
　　本课题分别从大鼠宏观体征、肺功能、血气分析、血流动力学评价和肺血管形态学分析等方面，验证采用多因素方法复制的 COPD痰瘀阻肺证大鼠模型成功。
　　基于“益气、化痰、祛瘀”之法创立的益气化痰祛瘀方—芪白平肺胶囊具有显著的舒张肺血管，改善模型大鼠的肺功能参数、降低平均肺动脉，缓解肺血管形态学改变，抑制低氧诱导的 PASMCs异常增殖的作用，对于防治COPD肺动脉高压具有较确切的疗效。
　　其机制可能通过介导 NO-cGMP-KATP途径，上调 eNOS，下调 iNOS水平，增加cGMP浓度，并上调KATP通道蛋白Kir6.1和SUR2B的表达而发挥其舒张肺动脉血管，缓解肺血管重构的作用，进而延缓 COPD发展进程。

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中文摘要

英文摘要

缩略词表 (ABBREVIATION)

前言

第一部分 理论研究

1 COPD肺气虚证的理论研究

2 ATP敏感性钾通道与COPD肺动脉高压相关性研究概况

第二部分 实验研究

研究一 芪白平肺胶囊介导 NO-cGMP-KATP途径对大鼠离体肺动脉环的舒张作用

研究二 芪白平肺胶囊对COPD痰瘀阻肺证大鼠离体肺动脉环的舒张作用

研究三 芪白平肺胶囊对COPD痰瘀阻肺证大鼠NO-cGMP-KATP途径的影响

研究四 芪白平肺胶囊介导 NO-cGMP-KATP途径对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

第三部分 讨论

1. 治疗COPD肺动脉高压采用“益气化痰祛瘀”治法的依据

2 COPD痰瘀阻肺证动物模型的建立与评价

3 芪白平肺胶囊可调控NO-cGMP-KATP途径舒张肺血管

4 芪白平肺胶囊含药血清介导 NO-cGMP-KATP 途径抑制低氧诱导的PASMCs增殖

结语

参考文献

附录：综述基于系统生物学的COPD肺气虚证证本质探究

研究生在学期间发表的论文

致谢