马传染性贫血病毒部分致弱毒株体外和体内的进化分析

摘要

我国研制成功的马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株DLV是将一株来源于马体的EIAV强毒LV(辽毒株)经过驴体连续传代100余代使其病毒毒力增强后获得了驴强毒株DV(对马和驴致死率为90％)，然后将该驴强毒株通过驴白细胞体外连续培养驯化120余代，使该毒株病毒毒力丧失的同时又保持了良好的免疫原性，最终培育成功了EIAV驴白细胞弱毒疫苗。将驴白细胞弱毒疫苗株进一步通过驴胎皮肤细胞继代，又获得比驴白细胞弱毒疫苗免疫保护效果更好的驴胎皮肤细胞弱毒疫苗FDDV。 为探讨驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株FDDV在免疫成熟马体内的进化规律，本研究采用nestPCR方法对FDDV免疫成熟马(FDDV免疫24个月后)体内的低拷贝的FDDV前病毒基因组DNA进行了分段(5段)扩增和序列分析，旨在找出FDDV长期在免疫马体内的进化规律并推导出其在体内的优势序列，通过与体外FDDV基因组进行比较分析，找到驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株FDDV体内体外演化过程中保守及变化区域。最终每段得到5个阳性克隆的序列。通过比较分析发现：免疫马体内LTR与FDDV3—8LTR的同源率平均为98.8％，env编码的氨基酸序列的同源率平均为96.1％。免疫马体内外FDDV的囊膜蛋白gp90变异较大，与体外gp90相比免疫马体内gp90的N—糖基化位点有增加现象。 为阐明EIAV疫苗的致弱机制和免疫保护机理，本研究采用LA-PCR技术对驴白细胞弱毒疫苗株减毒过程中第92代次毒株(DLV92)前病毒基因组DNA进行了扩增和序列分析，旨找出潜在的与毒力变化和免疫保护相关的稳定变异位点和相关特性。本实验成功的得到了8株接近DLV92全长的8Kb的前病毒基因组核酸序列。通过比较分析得出：DLV92与DLV878(疫苗株DLV，GenBank中登陆号为AF327878)同源率平均为98.1％，与LV877(EIAV强毒辽宁株LV，GenBank中登陆号为AF327877)核苷酸序列的同源率平均为97.7％。DLV92囊膜蛋白gp90上存在17个N—糖基化位点，与疫苗株DLV878一致，比亲本强毒LV877的囊膜蛋白gp90少4个糖基化位点，比DLV61少2个糖基化位点。本研究结果将为进一步研究EIAV致弱过程中毒力的变化和免疫保护的分子机制奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1 EIAV的历史和研究现状

1.2 EIAV形态结构和理化特性

1.3 EIAV的生物学特性

1.3.1 EIAV的血凝性

1.3.2 EIAV的细胞嗜性

1.3.3 EIAV的致病性

1.4国内外EIAV毒株及特性

1.5 中国EIA弱毒疫苗研制的路线

1.6 EIAV的分子生物学研究进展

1.6.1 gag基因及其编码蛋白

1.6.2 pol基因及其编码蛋白

1.6.3 env基因及其编码蛋白

1.6.4 EIAV的其它小开放阅读框架及其编码产物

1.6.5 EIAV的非编码区—LTR

1.7课题研究的目的和意义

第2章 EIAV驴白细胞弱毒疫苗致弱过程中第92代次毒株全基因组DNA的克隆与序列分析

2.1 材料

2.1.1病毒和细胞

2.1.2载体和菌株

2.1.3试剂及药品

2.1.4 培养基

2.1.5 引物

2.1.6主要仪器

2.2方法

2.2.1驴白细胞的分离与培养

2.2.2 DLV92前病毒基因组DNA的提取

2.2.3 DLV92全序列的PCR扩增

2.2.4 DLV92 PCR产物的克隆及测序

2.2.5序列分析

2.3结果与分析

2.3.1 DLV92前病毒DNA的PCR扩增产物及所得阳性克隆的鉴定

2.3.2 DLV92全序列核苷酸比较分析

2.3.3 DLV92 LTR序列比较分析

2.3.4 DLV92 gag基因比较分析

2.3.5 DLV92 pol基因比较分析

2.3.6 DLV92 env基因比较分析

2.3.7 DLV92 S1基因比较分析

2.3.8 DLV92 S2基因比较分析

2.3.9 DLV92 S3基因比较分析

2.4 讨论

2.4.1 DLV92 LTR的变异及生物学分析

2.4.2 DLV92 gag和pol的变异分析

2.4.3 DLV92 env的变异分析

第3章 免疫马体内EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株基因组的克隆与序列分析

3.1材料

3.1.1病毒与免疫马

3.1.2载体和菌株

3.1.3试剂及药品

3.1.4 培养基

3.1.5 引物

3.1.6主要仪器

3.2 方法

3.2.1免疫马体内FDDV前病毒基因组DNA的提取

3.2.2免疫马体内FDDV各片段序列的PCR扩增

3.2.3 PCR产物的克隆及测序

3.2.4 序列分析

3.3结果与分析

3.3.1免疫马体内FDDV前病毒DNA的PCR扩增产物及所得阳性克隆的鉴定

3.3.2免疫马体内FDDV LTR序列比较分析

3.3.3免疫马体内FDDV gag基因比较分析

3.3.4免疫马体内FDDV pol基因比较分析

3.3.5免疫马体内FDDV env基因比较分析

3.3.6免疫马体内FDDV S1基因比较分析

3.3.7免疫马体内FDDV S2基因比较分析

3.3.8免疫马体内FDDV S3基因比较分析

3.3.9免疫马体内FDDV的优势序列

3.4讨论

第4章结 论

参考文献

致 谢

附 录