响应面法优化Paracin1.7发酵条件及其产生菌遗传转化体系的初步建立

摘要

副干酪乳杆菌HD1.7(L.paracasei HD1.7)产生的抗菌肽Paracin1.7，对多种革兰氏阳性细菌(G+)、革兰氏阴性细菌(G-)以及酵母菌都有抑制作用，可作为新型食品防腐剂。本文通过Plackett-Burman设计和响应面(RSM)分析对L.paracasei HD1.7发酵产生Paracin1.7的培养基进行了优化。首先通过PB设计从8个因素中筛选出了有显著影响的葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰3个因素，然后通过最陡爬坡和Box-Behnken设计进一步优化，并利用JMP7.01软件进行回归分析，得到以上3个因素的最佳浓度分别为(g/L)：葡萄搪6.5685、硫酸镁0.454、硫酸锰0.01052。在优化后的培养基下，Paracin1.7效价达到141.648 AU/mL，比优化前(74.13 AU/mL)提高了1.91倍。
　　 本实验用自杀质粒pUC18-prcR-tet，对影响L.paracasei HD1.7电转化的几个主要因素进行了初步研究，建立了较优化的电转条件：当L.paracasei HD1.7生长8h时，加入青霉素使终浓度为12.5μg/mL，再培养1h。经AEB1电转缓冲液(蔗糖浓度为0.3mol/L)处理后，在1.8～2.0 kv电压下完成电击，并迅速加入MRS培养基中，复苏5h。最后得到了最佳的电转化条件。
　　 抗菌肽的生成过程具有群体效应(QS)的特征，prcR是群体效应过程中调节因子的编码基因。通过电转化将自杀质粒pUC18-prcR-tet导入L.paracasei HD1.7，经基因敲除技术，获得prcR突变株，对能在Tet平板上生长的菌株进行PCR验证，最后证明，突变菌株表现出了四环素抗性，质粒pUC18-prcR-tet已被转入L.paracasei HD1.7中，但没有在指定位置发生同源重组。通过抑菌试验观察突变株的抑菌情况发现，突变株要比原始菌株的抑菌程度弱，这说明突变株中影响抗菌肽的相关基因有所变化，进而影响了抗菌肽的生成。
　　 本文对L.paracasei HD1.7产Paracin1.7进行了研究，通过优化培养基成分使Paracin1.7产量得到提高。并通过电转化方法对影响群体效应的调节基因prcR进行了探索。这些研究为以后工业化生产抗菌肽，广泛应用于食品药品、探讨乳酸菌群体效应现象以及研究抗菌肽基因的克隆表达等工作奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第1章 绪论

1.1乳酸菌抗菌肽

1.1.1乳酸菌抗菌肽的分类

1.1.2乳酸菌抗菌肽的应用

1.2抗菌肽发酵工艺的研究

1.2.1培养基组分对抗菌肽产量的影响

1.2.2发酵工艺优化方法―响应面优化法

1.3抗菌肽产量的影响因素

1.4细菌的群体感应

1.4.1细菌群体感应现象的提出

1.4.2群体感应信号传导系统

1.4.3细菌群体感应系统的应用

1.5乳酸菌遗传转化体系的研究

1.5.1乳酸菌的转化方法

1.5.2乳酸菌电转化的影响因素

1.6本研究的目的和意义

1.7本研究的主要技术路线

1.8本课题资助

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2扩增引物

2.1.3培养基

2.1.4主要试剂及药品

2.1.5试剂盒

2.1.6主要仪器设备

2.2 L.paracasei HD1.7生长曲线与产抗菌肽动态变化过程的研究

2.2.1 L.paracasei HD1.7生长曲线测定

2.2.2 L.paracasei HD1.7产抗菌肽动态变化过程

2.3响应面法优化Paracin 1.7发酵条件

2.3.1产抗菌肽条件优化单因素试验

2.3.2 Plackett-Burman设计

2.3.3最陡爬坡试验设计

2.3.4中心组合试验设计

2.3.5响应面模型验证

2.4副干酪乳杆菌遗传转化体系的建立

2.4.1 pUC18-prcR-tet质粒的提取及验证

2.4.2四环素对L.paracasei HD1.7最小抑制浓度的测定

2.4.3 L.paracasei HD1.7感受态细胞的制备

2.4.4 L.paracasei HD1.7电转化条件的研究

2.4.5基因敲除突变株的筛选和鉴定

2.4.6菌株的质粒提取及消除

2.4.7突变株生长及其发酵液抑菌情况

第3章结果与分析

3.1 L.paracasei HD1.7产抗菌肽发酵条件优化的前期准备

3.1.1 L.paracasei HD1.7的生长曲线测定

3.1.2 L.paracasei HD1.7产抗菌肽动态变化过程的研究

3.2响应面法优化产抗菌肽发酵条件的研究

3.2.1 Plackett-Burman设计法筛选显著因子

3.2.2最陡爬坡试验

3.2.3中心组合设计法确定显著因素的最优水平

3.2.4验证试验

3.3副干酪乳杆菌遗传转化体系的建立

3.3.1 pUC18-prcR-tet质粒的提取及酶切验证

3.3.2四环素对L.paracasei HD1.7的最小抑制浓度

3.3.3 L.paracasei HD1.7的电转化

3.3.4基因敲除突变株的筛选和鉴定

3.3.5菌株的质粒消除结果

3.3.6突变株的生长测定

3.3.7突变株发酵液抑菌情况

3.4总结

第4章讨论

4.1抗菌肽发酵工艺的优化

4.2 L.paracasei HD1.7电转化条件的影响因素

4.3基因敲除突变株的鉴定

第5章结论

参考文献

致谢