拟南芥葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD5)基因的克隆及功能研究

摘要

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PDH，EC1.1.1.49)，是磷酸戊糖途径第一个酶，也是这一途径的限速酶，它所催化的反应是生物细胞中NADPH的主要来源之一。G6PDH广泛分布于各类细胞中，是一种具有重要调控作用的胞内酶。G6PDH不仅对生物生长有着重要作用，它所提供的NADPH参与了细胞内的很多反应或循环，为这些反应提供还原力，同时G6PDH在植物的抗氧化机制中也扮演着极其重要的角色。
　　 本实验从哥伦比亚生态型拟南芥中克隆出G6PD5基因，通过构建克隆载体对其序列进行了检测和比对;为了验证G6PDH的功能，本实验构建了植物表达载体并对拟南芥进行侵染，成功培育出G6PD5超表达体系拟南芥。通过对比野生型拟南芥(At)、G6PD5超表达体系拟南芥(G6PD5)和G6PDH被抑制的拟南芥(g6pd5)的生长状况和生理指标，验证了G6PD5的对植物生长的重要作用。结果表明，G6PD5组拟南芥在长势上略优于At组，而g6pd5组的拟南芥明显弱于其他两组。对其常态酶活的测定结果显示At组拟南芥G6PDH酶活达到27.5U/mg，G6PD5组的酶活达到52U/mg，提高了89.1％;而g6pd5组拟南芥的酶活则为17.5U/mg，降低了36.4％。
　　 实验还将各组拟南芥进行了不同程度的氧胁迫处理，通过对不同处理条件下的不同组拟南芥幼苗中与氧化胁迫有关的小分子物质(O2-，GSH)以及相关酶（GR）的测定，对三组拟南芥的抗氧化胁迫能力进行对比。在NaCl处理下的个组拟南芥，其中G6PD5组的酶活下降幅度最小，由92.5U/mg降低到72.9U/mg，降低了21％，其他两组的G6PDH活性分别降低了55.6％、59.7％;NaHCO3处理下G6PD5组的酶活降低了70.5％，其他两组的G6PDH活性分别降低了88.9％、89.5％;H2O2处理中G6PD5组的酶活降低了23.2％，其他两组的G6PDH活性分别降低了33％、62.8％。本实验分别选取100mmol/LNaCl、30mmol/LNaHCO3、40mmol/LH2O2处理后的拟南芥幼苗，对其O2-的含量、GSH含量、GR活性进行测定。实验结果显示，G6PD5组的拟南芥O2-增加量较小，分别增加了74％，90％，212％，At组分别增加了169％，149％，325％，g6pd5组分别增加了261％、226％、375％;G6PD5组拟南芥GSH含量分别增加了32％，38.3％，46.8％，At组分别增加了30.1％，21.3％，41.8％，g6pd5组分别增加了22.3％、-6.1％、10.6％;G6PD5组的拟南芥GR活性分别增加了75.4％，86％，23.8％，At组分别增加了55.8％，78.7％，18.3％，g6pd5组分别增加了-22.2％、-12.7％、7.9％。
　　 G6PD5超表达体系拟南芥中无论是G6PDH还是GR得活性都会比其他两组拟南芥更稳定，这一组拟南芥可以在较大范围的胁迫程度中保持其酶活的相对稳定，且能够有效的清除对其自身有害的O2-，使O2-能够保持在较低的水平。实验表明，G6PD5不仅在植物的生长中不可或缺，在植物应对氧化胁迫的过程中也有着重要的作用。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 G6PD基因的研究概况

1．1．1 G6PD基因家族

1．1．2 G6PD基因的特性

1．1．3 G6PD基因的研究现状

1．2 植物磷酸戊糖途径

1．2．1 磷酸戊糖途径概述

1．2．2 磷酸戊糖途径发生的场所

1．3 GSPD基因的抗氧化机制

1．3．1 氧化胁迫对植物的伤害

1．3．2 植物对氧化胁迫的适应机制

1．3．3 G6PD的抗氧化机制

1．4 本课题的研究内容及意义

第2章 GSPD基因的克隆及表达载体的构建

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料及仪器

2．1．2 植物材料的培养及RNA的提取

2．1．3 拟南芥G6PD5基因功能区序列的克隆

2．1．4 植物表达载体的构建

2．1．5 电转化将植物表达载体转化到根癌农杆菌中

2．1．6 根癌农杆菌介导的模式植物拟南芥的遗传转化

2．1．7 转基因植株的生物学检测

2．2 结果与分析

2．2．1 植物材料的培养及RNA的提取

2．2．2 拟南芥G6PD5基因功能区序列的克隆

2．2．3 植物表达载体的构建

2．2．4 重组质粒在农杆菌中阳性克隆的筛选与鉴定

2．2．5 转基因再生植株的生物学检测

2．3 本章小结

第3章 G6PDH的活性测定及抗氧化功能的研究

3．1 材料及方法

3．1．1 实验材料、试剂及仪器

3．1．2 G6PDH生理生化基本测定

3．1．3 胁迫处理后G6PDH在细胞中的调节作用

3．2 结果分析

3．2．1 生物形态和G6PD5表达量分析

3．2．2 G6PDH活性测定分析

3．2．3 胁迫条件下G6PDH与ROS的关系

3．2．4 胁迫条件下G6PDH与谷胱甘肽水平的关系

2．3 本章小结

结论

参考文献

致谢

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