羊草TPI基因克隆及其相关基因对逆境胁迫的响应分析

摘要

羊草（Leymus chinensis）具有很强的抗寒、抗旱、耐盐碱及耐土壤瘠薄能力，在生态环境保护中占有重要地位。羊草的灰绿型和黄绿型是两个表型明显不同，在光合生理生态特性、抗干旱、耐盐碱胁迫等方面具有稳定遗传差异的生态型，但其分子机制尚未阐明。因此，本研究分析了这两种生态型羊草中与碳代谢相关的差异蛋白基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（LcGAPDH）和磷酸丙糖异构酶（LcTPI）在盐碱和干旱胁迫下的表达，并克隆LcTPI基因，构建p1304-LcTPI植物表达载体，转化拟南芥初步进行了LcTPI功能分析。
　　磷酸丙糖异构酶(TPI)是一种参与碳代谢的关键酶，响应多种逆境胁迫，与甲基乙二醛（MG）在植物体内的代谢水平密切相关。本研究利用RACE技术克隆得到黄绿型羊草LcTPI基因两个不同长度（1069bp和1053bp）的全长序列。两种生态型羊草TPI基因ORF区长762bp，编码253个氨基酸；在DNA水平上，从起始密码子到终止密码子黄绿型TPI为2787bp，灰绿型TPI为2776bp，这种数目不同是因二者内含子的差异所致。
　　生物信息学分析表明，克隆的 LcTPI基因为细胞质型；LcTPI蛋白分子量为26.94KD，等电点5.57；LcTPI有4个糖基化位点和15个磷酸化位点，含有TIM家族成员共有的典型结构域，其二级结构中α-螺旋占47.83％、不规则卷曲占28.85%、β-折叠占16.21%、β-转角占7.11%。进化树分析显示，该蛋白与其它单子叶植物中同源蛋白亲缘关系更近。
　　构建LcTPI植物表达载体，导入农杆菌GV3101中，通过蘸花法转化拟南芥，在潮霉素培养基上筛选抗性转化体，PCR鉴定得到阳性转基因植株。转 LcTPI拟南芥对甲基乙二醛（MG）胁迫表现抗性。
　　以200mM中性盐、200mM碱性盐及20%PEG胁迫处理灰绿型和黄绿型羊草植株以分析 LcTPI和LcGAPDH对逆境胁迫的应答。通过 qRT-PCR显示，LcTPI和LcGAPDH对3种胁迫条件均有响应，但基因的表达水平变化表现不同；两种生态型中LcTPI和LcGAPDH在3种胁迫下转录变化水平存在差异，可能与两种生态型羊草的抗逆性不同有关。

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第1章 绪 论

1.1羊草的遗传多样性及其分化的研究现状

1.2两种生态型羊草差异蛋白及其编码基因的研究进展

1.3技术路线

1.4本研究的目的和意义

第2章 羊草TPI基因的克隆

2.1材料与试剂

2.2实验方法

2.3结果分析

2.4讨论

2.5小结

第3章 羊草磷酸丙糖异构酶的生物信息学分析

3.1实验方法

3.2结果分析

3.3讨论

3.4小结

第4章 LcTPI表达载体构建、对拟南芥的转化鉴定及功能分析

4.1材料与试剂

4.2实验方法

4.3结果分析

4.4讨论

4.5小结

第5章 逆境胁迫下两种生态型羊草TPI和GAPDH基因的转录分析

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果分析

5.4讨论

5.5小结

结论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

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