骨碎补总黄酮的富集工艺及其对Aβ25-35诱导PC12损伤细胞保护作用研究

摘要

阿尔茨海默症是认知、调控能力逐渐改变的一种神经性疾病，目前尚未有有效的医学治疗手段，治愈阿尔茨海默病已成为全世界攻克的难题。传统医学认为，阿尔茨海默症的病因由多种因素引起，多为肾气虚衰，致髓海不足，脑髓空虚而使脑组织萎缩、功能减退而致呆痴，故补肾益精填髓是治疗之根本。骨碎补(Drynaria fortunei)是传统补肾良方，临床上常用于治疗老年记忆衰退。现代药理学表明，骨碎补中黄酮类化合物是改善记忆功能的主要活性成分，故本实验筛选优化了骨碎补总黄酮的富集工艺，并考察了骨碎补总黄酮对Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞的保护作用。
　　首先，建立骨碎补总黄酮的紫外定量分析方法，以柚皮苷标准品为对照品，考察精密度、稳定性、重复性、回收率，用于评价和优化骨碎补总黄酮的富集工艺。
　　其次，分别考察50％、55％、60％、70％、80％乙醇对总黄酮的提取效果，确定55％乙醇为最佳提取溶剂。考虑到工业化生产可行性，最终选择乙醇加热回流作为总黄酮的提取方法。采用L9(34)正交试验法对乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数四因素进一步的综合考察，从而确定骨碎补总黄酮的最佳提取工艺:55％乙醇为提取溶剂，14倍体积的生药量，加热回流提取3次，每次1.5h。
　　通过考察树脂吸附性、解吸性等性能，最终确定AB-8型树脂为最佳大孔树脂。以单因素实验和正交试验法，优化出骨碎补总黄酮的最佳富集工艺:AB-8型大孔树脂20g，径高比1∶5，吸附10mL(20mg.L-1)的总黄酮水溶液(pH=4.0，20℃)24h，分别用8BV的水和50％8BV的乙醇以1.0mL/min流速进行洗脱，收集合并50％乙醇洗脱液，经减压浓缩后得骨碎补富集物。富集物中骨碎补总黄酮的含量为76.11％，总黄酮转移率78.82％，柚皮苷含量为20.41％，柚皮苷转移率为76.53％。
　　最后，将Aβ25-35诱导后的PC12细胞做为阿尔茨海默症体外细胞模型，并将纯化后不同浓度的骨碎补总黄酮作用于细胞模型上。利用MTT法检测出最佳药物作用浓度，2×10-7g/mL骨碎补纯化物对Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞保护作用最强，在该浓度下作用于Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞，检测细胞存活率。实验得出在浓度为2×10-7g/mL的给药组中细胞的增殖率显著升高(P＜0.01)，其细胞增殖率达到93％。说明纯化后的骨碎补总黄酮对损伤后的PC12细胞具有一定的保护作用。
　　本实验建立了骨碎补总黄酮定量分析方法，通过方法学考察证明其准确性、重复性及稳定性良好，可用于骨碎补中总黄酮的含量测定;优化了骨碎补中总黄酮有效部位的最佳提取、富集工艺，方法简单可行性强，富集物中总黄酮类成含量较高、总黄酮转移率较好。体外细胞实验证实骨碎补总黄酮具有保护的中枢神经作用，骨碎补总黄酮对治疗阿尔茨海默病具有极大的潜在药用价值。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 骨碎补的研究现状

1．1．1 骨碎补的化学成分研究

1．1．2 骨碎补药理作用研究

1．2 总黄酮的富集工艺

1．2．1 总黄酮的提取方法

1．2．2 总黄酮的富集方法

1．3 植物总黄酮治疗阿尔茨海默病的潜在作用

1．4 立题依据与研究意义

第2章 骨碎31、总黄酮定量分析方法的建立

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验药品

2．1．3 骨碎补药材

2．2 骨碎补总黄酮UV定量分析方法

2．2．1 对照品溶液的制备

2．2．2 供试品溶液的制备

2．2．3 方法学考察

2．3 本章小结

第3章 骨碎补总黄酮提取富集工艺优化

3．1 实验材料

3．1．1 实验仪器

3．1．2 实验药品

3．2 骨碎补黄总酮提取工艺研究

3．2．1 提取溶剂的选择

3．2．2 正交试验

3．2．3 验证实验

3．3 骨碎补总黄酮富集工艺优化

3．3．1 大孔树脂的筛选

3．3．2 静态吸附性毹的考察

3．3．3 动态吸附性能的考察

3．3．4 最佳大孔树脂吸附工艺的考察

3．3．5 验证试验

3．4 本章小结与讨论

第4章 骨碎补总黄酮对Aβ25-35损伤PC12细胞保护作用研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验仪器

4．1．2 实验药品

4．2 实验内容

4．2．1 细胞溶液的配制

4．2．2 MTT溶液的配制

4．3 PC12细胞复苏、传代

4．3．3 药物作用浓度的筛选

4．3．4 骨碎补总黄酮分组

4．3．5 MTT法检测细胞活力

4．3．6 统计方法

4．4 实验结果

4．4．1 药物作用有效浓度

4．4．2 骨碎补总黄酮对Aβ25-35诱导PC12细胞的影响

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

声明

致谢