黄瓜CsMPC1和CsE1α基因在线粒体介导植物PCD中的作用研究

摘要

水杨酸(SA)是植物防御的关键信号因子，可以诱导某些抗病基因的表达，在植物抗病中起重要作用。课题组前期研究证实，SA能够诱导黄瓜叶片发生超敏反应(HR)，是一个细胞程序性死亡(PCD)的过程。为进一步探究SA的作用机制，对SA处理前后的黄瓜叶片进行了转录组分析，得到1756个差异表达基因。本研究选择与线粒体功能相关的显著上调表达的CsMPC1和CsE1α基因，研究其表达特性，利用超表达拟南芥和突变体拟南芥研究基因的功能，为揭示基因在线粒体介导的PCD中的作用奠定基础。研究结果如下: 1.用10mM SA和0.2％MeJA分别处理黄瓜叶片，在营养器官根、茎、叶和MeJA处理叶片进行CsMPC1和CsE1α基因的qRT-PCR表达分析，并对根、茎、叶和SA和MeJA处理叶片进行相应指标丙酮酸(PA)含量和丙酮酸脱氢酶(PDH)活性测定。CsMPC1和CsE1α基因在叶片中具有较高表达量，在MeJA处理介导PCD过程皆呈上调表达调控;CsMPC1丙酮酸转运体基因水平改变引起其转运PA含量的变化，比较发现两者呈负相关;CsE1α丙酮酸脱氢酶基因水平的改变影响PDH活性的变化，比较发现两者呈正相关。但MeJA和SA处理发生PCD过程中PDH活性无明显变化。 2.根据mRNA开放读码区序列设计引物，从黄瓜中克隆CsMPC1和CsE1α基因。CsMPC1基因cDNA全长311bp，蛋白由103个氨基酸构成。CsE1α基因cDNA全长1199bp，蛋白由399个氨基酸构成。通过NCBI BlastX比对测序结果显示CsMPC1属于MPC超家族，CsE1α属于TPP超家族。 3.构建CsMPC1和CsE1α基因的超表达载体，通过农杆菌介导的浸花法将质粒转入到野生型拟南芥植株中，获得了转CsMPC1和CsE1α基因拟南芥植株。利用三引物法将从拟南芥生物资源中心获得MPC1基因(SALK_089763.42.10.x)和E1α基因(SALK_056967.56.00.x)T-DNA插入突变体进行PCR鉴定获得纯合株系。 4.对筛选出的MPC1和E1α的超表达拟南芥植株(OE-1和OE#-1)和突变体拟南芥植株（mpc1-1和E1α-1）进行表型鉴定、生理指标测定和PCD鉴定。结果如下: (1)突变体植株mpc1-1对ABA敏感，具有抗旱的功能;超表达植株OE-1转运PA水平升高，表明PA转运体行使功能;突变体植株mpc1-1转运PA水平降低，表明PA转运受到阻碍，导致线粒体功能下降，糖酵解途径增强，植株生长受到抑制，但在超表达和突变体植株中均未检测到PCD现象。说明MPC1基因超表达与敲除时，PA代谢发生变化但并不影响植物PCD的发生，这是因为在MPC1基因敲除时MPC家族其他转运蛋白仍在行驶功能，MPC1基因超表达时植株正常生长没有出现细胞死亡现象。 (2)超表达植株OE#-1正常生长，并且PDH活性与WT无明显差异，没有出现细胞死亡的现象;在突变体植株E1α-1中PDH活性受到抑制，生物体的有氧代谢受到阻碍，严重阻碍细胞的呼吸，导致ROS大量积累，可能引起植物PCD发生，从而影响植株正常生长发育。这说明E1α基因敲除可能引起植物PCD的发生。

目录

摘要

第1章绪论

1．1植物PCD的研究进展

1．1．1植物PCD的发生机制

1．1．2植物PCD中线粒体介导作用的研究进展

1．2水杨酸和茉莉酸的研究进展

1．2．1水杨酸和茉莉酸的研究现状

1．2．2水杨酸和荣莉酸在植物防御中的信号传递

1．2．3水杨酸和茉莉酸与PCD的关系

1．3植物PCD中线粒体相关基因的研究进展

1．3．1线粒体丙酮酸转运体研究进展

1．3．2线粒体丙酮酸脱氢酶研究进展

1．4本研究的目的意义、研究内容与技术路线

1．4．1本研究的目的与意义

1．4．2研究内容

1．4．3技术路线

第2章黄瓜CsMPCl和CsElα基因的表达分析

2．1植物材料的培养

2．1．1植物材料的培养和前期处理

2．1．2引物

2．1．3化学试剂和试剂盒

2．1．4仪器

2．1．5营养液的配制

2．2试验方法

2．2．1黄瓜叶片的总RNA提取

2．2．2 cDNA的合成

2．2．3黄瓜线粒体相关基因CsMPCl和CsElα的表达检测

2．2．4黄瓜丙酮酸(pyruvic acid，PA)含量和丙酮酸脱氢酶(Pyruvatedehydrogenase，PDH)活性测定

2．2．5统计分析

2．3结果与分析

2．3．1水杨酸、茉莉酸甲酯处理黄瓜叶片的形态变化

2．3．3 CsMPCl和CsElα基因的RT-PCR表达分析

2．3．4 CsMPCl和CsElα基因的qRT-PCR表达分析

2．3．4丙酮酸(pyruvic acid，PA)含量和丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)活性的测定

2．4讨论

2．4．2 CsMPCl和CsElα基因的表达水平与相关生理指标的关系

第3章黄瓜CsMPCl和CsElα的编码区全长序列的克隆及生物信息学分析

3．1试验材料

3．1．1植物材料的培养

3．1．2菌株

3．1．3化学试剂和试剂盒

3．1．4主要仪器

3．2试验方法

3．2．1黄瓜总RNA的提取

3．2．2基因扩增

3．2．3 CsMPCl和CsElα基因cDNA序列克隆

3．2．4克隆产物序列测定及分析

3．3结果与分析

3．3．2黄瓜CsMPCl和CsElα基因测序及序列分析

3．4讨论

第4章黄瓜CsMPCl和CsElα基因表达载体的构建及转化拟南芥

4．1试验材料

4．1．1植物材料的培养

4．1．2载体与菌株

4．1．3化学试剂和试剂盒

4．2试验方法

4．2．1表达载体构建

4．2．2重组质粒导入农杆菌

4．2．3浸花法转化拟南芥

4．2．4转化拟南芥株系的筛选

4．2．5转基因拟南芥的PCR鉴定

4．2．6转基因拟南芥的qRT-PCR检测

4．3结果与分析

4．3．2黄瓜pBI121-CsMPCl／CsElα农杆菌转化及验证

4．3．3转基因拟南芥的PCR鉴定

4．3．4转基因拟南芥的qRT-PCR检测

4．4 讨论

第5章MPCl和Elα的超表达和突变体拟南芥生理指标测定和PCD鉴定

5．1试验材料

5．1．1植物材料的培养

5．1．2化学试剂和试剂盒

5．1．3主要仪器

5．2试验方法

5．2．1纯合突变体植株的筛选

5．2．2 MPCl和Elα的超表达和突变体拟南芥植株形态观察和表型鉴定

5．2．4 MPCl和Elα仅的超表达拟南芥和突变体拟南芥植株相关生理指标鉴定

5．2．5 MPCl和Elα的超表达和突变体拟南芥PCD鉴定

5．2．6统计分析

5．3结果与分析

5．3．2 MPCl和Elα的超表达和突变体拟南芥植株形态分析

5．3．3 MPCl和Elα的超表达和突变体拟南芥植株表型鉴定

5．3．4 mpcl-l突变体拟南芥对干旱胁迫响应分析结果

5．3．5 MPCl和Elα的超表达和突变体拟南芥植株相关生理指标鉴定

5．3．6 MPCl和Elα的超表达和突变体拟南芥PCD鉴定结果

5．4讨论

5．4．2 Elα基因与PCD的关系

5．5本研究的创新点和下一步工作

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

声明

致谢