腈水合酶固定化细胞的载体选择及复合固定化的研究

摘要

细胞固定化是在酶固定化基础上发展起来的一种高新技术和方法，它既可以提高生产效率和生产能力，延长生产周期，又易于细胞的分离和回收，已广泛应用于食品工业、轻化工业、制药工业、发酵工业和三废处理工业。本文利用细胞固定化技术选择合适载体固定腈水合酶产生菌株Rhodococcus sp.HUST-3催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺，以解决现阶段生产中存在的酶活力损失严重、工艺过程复杂、后处理要求高等问题。 首先，使用海藻酸钠、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖、琼脂等常用载体固定腈水合酶产生菌Rhodococcus sp.HUST-3，并对其固定化条件进行优化。研究发现，五种固定化细胞的相对酶活力分别为68.3％、62.3％、60.7％、82.9％、55.5％，同时发现琼脂不适合固定该菌株，而海藻酸钠、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖四种载体固定的细胞则各有优点：海藻酸钠固定化细胞制备简单球形规则，聚乙烯醇固定化细胞直径最大，聚丙烯酰胺固定化细胞强度最高，壳聚糖固定化细胞酶活最高，因此可以对四种载体进行复合使用。 其次，对海藻酸钠载体制备的固定化细胞进行了正交实验和性质测定。研究发现，各因素对海藻酸钠固定化细胞的影响程度依次为：海藻酸钠浓度>海藻酸钠与菌液体积比> CaCl2浓度。此外，海藻酸钠固定化细胞的最佳固定化时间为6h，最适底物丙烯腈浓度为40g/L，最适水合催化pH值为7.0，最适水合催化温度为28℃。 最后，以海藻酸钠作为最基本载体，与聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖分别复合固定腈水合酶产生菌株。研究发现，三种复合载体制备的固定化细胞的相对酶活力分别为93.1％、92.7％、97.6％，其中海藻酸钠－壳聚糖复合载体最适合固定腈水合酶产生菌Rhodococcus sp.HUST-3水解丙烯腈生产丙烯酰胺，其固定化方法为：将3.5％海藻酸钠溶液与1g/L腈水合酶菌悬液按体积比20：1混合均匀，用注射器平稳滴入4％CaCl2溶液中制成海藻酸钠固定化细胞，再将海藻酸钠固定化细胞置于1.6％壳聚糖醋酸溶液中覆膜30min即得海藻酸钠－壳聚糖固定化细胞，该法制备工艺操作简单，原料价格低廉易得，制得的固定化细胞机械强度高，酶活转化率为97.6％，比传统海藻酸钠固定化细胞提高29.3％，同时可以进行12批次连续水合反应。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1丙烯酰胺概述

1.1.1丙烯酰胺的性质

1.1.2丙烯酰胺的用途及市场前景

1.1.3丙烯酰胺生产技术回顾

1.2腈水合酶研究简介

1.2.1腈水合酶的种类及分布

1.2.2腈水合酶的结构特点

1.2.3腈水合酶的反应机理

1.2.4腈水合酶的热稳性

1.3细胞固定化技术简介

1.3.1细胞固定化技术的发展历程

1.3.2细胞固定化技术的优缺点

1.3.3细胞固定化的主要方法

1.3.4细胞固定化的主要载体

1.3.5固定化细胞批式反应工艺流程

1.4固定化腈水合酶生产丙烯酰胺的研究进展

1.5课题背景

1.5.1课题来源

1.5.2本课题的研究目的与意义

1.5.3本课题的主要研究内容

第2章固定化载体的选择和条件优化

2.1材料和方法

2.1.1菌种和培养基

2.1.2仪器和试剂

2.1.3游离细胞的制备

2.1.4固定化细胞的制备

2.1.5性质测定

2.2五种固定化载体的条件优化

2.2.1海藻酸钠(SA)包埋法

2.2.2聚乙烯醇(PVA)包埋法

2.2.3聚丙烯酰胺(PAM)包埋法

2.2.4壳聚糖(CA)交联法

2.2.5琼脂(Agar)包埋法

2.3五种固定化载体的性质比较

2.4本章小结

第3章海藻酸钠固定化细胞的性质研究

3.1材料和方法

3.1.1菌种和培养基

3.1.2性质测定

3.2海藻酸钠包埋法的正交实验

3.3海藻酸钠包埋法的固定化时间

3.4海藻酸钠固定化细胞的水合催化条件

3.4.1底物丙烯腈浓度

3.4.2 pH值

3.4.3温度

3.5本章小结

第4章海藻酸钠复合载体制备固定化细胞

4.1材料和方法

4.1.1菌种和培养基

4.1.2固定化细胞的制备

4.2海藻酸钠复合固定化细胞的条件优化

4.2.1海藻酸钠—聚乙烯醇(SA-PVA)联合固定法

4.2.2海藻酸钠—聚丙烯酰胺(SA-PAM)联合固定法

4.2.3海藻酸钠—壳聚糖(ACA)联合固定法

4.3三种海藻酸钠复合载体的性质比较

4.3.1固定化细胞的形态比较

4.3.2固定化细胞的反应批次比较

4.3.3固定化细胞的综合性质比较

4.4本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢