高速逆流色谱法分离制备蜂毒肽

摘要

高速逆流色谱(high-speedcounter-currentchromatography，简称HSCCC)是一种新型的利用液-液分配原理进行分离的一种色谱技术。其不使用固体作为载体，避免了固相载体的不可逆吸附和峰形拖尾等不利现象。可以粗品直接进样，可以实现分离纯化与制备同步完成。目前高速逆流色谱已广泛的运用于天然产物、海洋活性成分、无机物、抗生素等物质的分离纯化中。
　　蜂毒是工蜂用其螯针刺敌时分泌的一种毒汁，其成分十分复杂，主要为肽类、酶类及非肽类物质。其中蜂毒肽是蜂毒主要组成成分及活性成分，是一种含有26个氨基酸残基的阳离子抗菌肽。其能抗炎、镇痛、抑制血小板凝集。但由于蜂毒中成分复杂且多呈碱性，因此从粗蜂毒中纯化蜂毒肽比较困难。目前国内外多采用多步层析的方法制备纯化蜂毒肽，其过程繁琐，成本高，所得制品需要样品前处理及后续处理。
　　本文采用高速逆流色谱方法，建立一种新的分离蜂毒肽方法，鉴定了所得产物的分子量及氨基酸一级结构，证明分离所得物质为蜂毒肽。此方法降低了成本，样品无需前处理，所得产物不需后续处理，增加了一次分离量。
　　根据蜂毒肽的极性及理化性质，参考国内外溶剂体系比例组成，选择了多种溶剂体系进行初步选择，最后总结了五种可参考数据的溶剂体系：正己烷/甲醇/水、正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水、苯/乙酸乙酯/甲醇/水、氯仿/甲醇/水，氯仿/甲醇/水(醋酸)。比对了这五种体系的不同比例组合的K值和分层时间后，选择了正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水体系的1/1/1/1(v/v)、1/6/1.5/7.5(v/v)及3/7/5/5(v/v)三种比例组份体系；苯/乙酸乙酯/甲醇/水的1/1/1/1(v/v)体系；氯仿/甲醇/水的1/1/1/1(v/v/v)及4/3/2(v/v/v)体系；以及氯仿/甲醇/水(醋酸0.2mol/L)的1/1/1(v/v/v)及4/3/2(v/v/v)体系。考察这些体系的固定相保留率、HSCCC平衡时间及是否出峰，保留了正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水的3/7/5/5(v/v)体系。对此体系进行分离条件优化，得到最佳分离条件：HSCCC螺旋管转数为850rmp、流动相流速为1mL/min及循环水浴温度为25℃。最后对HSCCC分离产物进行分子量测定，所得分析量为2845，并根据一级结构的鉴定得知所得分离产物为蜂毒肽。

目录

高速逆流色谱法分离制备蜂毒肽

PREPARATIVE SEPARATION OF MELITTIN BY HIGH SPEED COUNTER-CURRENT CHROMATORGRAPHY

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 课题研究背景

1.2 高速逆流色谱

1.3 蜂毒肽

1.4 本课题的研究目的及意义

1.5 本课题主要研究内容

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验设备

2.3 标准对照样品及样品溶液制备

2.4 分配系数及固定相保留率测定

2.5 蜂毒肽分离的溶剂体系选择

2.6 蜂毒肽的制备

第3章 蜂毒肽分离的溶剂体系选择

3.1 紫外分光法筛选溶剂体系

3.2 HSCCC法筛选溶剂体系

3.3 HSCCC加标准对照样品筛选

3.4 本章小结

第4章 蜂毒肽的制备

4.1 分离条件优化

4.2 蜂毒肽的分离

4.3 HSCCC方法的精确度及准确度

4.4 分离产物鉴定

4.5 本章小结

结论

附图

参考文献

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