中性粒细胞对结核分枝杆菌吞噬和杀伤活性的探讨

摘要

研究背景：嗜中性粒细胞或多形核细胞（polymorphonuclear cells, PMN）是机体天然免疫的主要免疫细胞。在炎症反应中,中性粒细胞（PMN）是最先到达感染部位的细胞，对炎症的发生、发展和转归起到了关键作用。结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)感染引起的，目前仍是发病率和病死率最高的传染病之一。一般认为巨噬细胞和淋巴细胞在抗结核感染免疫中起重要作用，而PMN在结核感染中的作用却一直很少被注意到。近年来研究发现，PMN这一具有天然免疫作用的细胞可能也参与抗结核感染的免疫保护作用，但PMN在抗结核感染的免疫保护作用中的确切机制尚未明确。探讨PMN在抗结核感染的天然免疫作用的具体作用机理，对全面了解结核病的发病机制和机体抗结核感染的免疫保护机制，具有重要的理论意义和临床应用价值。
　　目的：建立用流式细胞术检测人外周血PMN吞噬M.tb的方法；观察Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ、Th1型细胞诱导因子IL-12，Th2型细胞因子IL-4以及共同细胞因子GM-CSF对人外周血PMN吞噬M.tb活性的影响；观察人外周血PMN吞噬M.tb后呼吸爆发活性氧（ROS）产生；建立流式细胞术检测人外周血 PMN杀伤M.tb的实验方法。
　　方法：
　　1.用不同浓度异硫氰酸荧光素（FITC）在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）和碳酸盐缓冲液（CB，pH9.5）中标记M.tb，流式细胞术检测标记率和荧光强度（MFI）。2.取新鲜健康成人外周血与标记M.tb于37℃孵育5～20 min后，洗涤和溶血，用流式细胞术检测PMN吞噬百分率。
　　3.取新鲜健康成人外周血与M.tb于37℃孵育20 min后，洗涤和溶血，抗酸染色，显微镜观察PMN吞噬M.tb。
　　4.取健康成人外周血与FITC标记的M.tb和抗人CD16-PE，置37℃水浴孵育20 min，溶血和洗涤，激光共聚焦显微镜观察PMN吞噬M.tb。
　　5.外周血预先分别与不同浓度的Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，以及Th1型细胞诱导因子IL-12孵育2 h,再加标记M.tb孵育5 min，流式细胞术检测PMN吞噬率，并与对照组比较计算吞噬增加比率。
　　6.外周血预先分别与不同浓度的Th2型细胞因子 IL-4和共同细胞因子 GM-CSF孵育2 h,再加标记M.tb分别孵育5 min和15 min，流式细胞术检测PMN吞噬率，并与对照组比较计算吞噬变化比率。
　　7.取健康成人外周血与M.tb和2′7′二氯二氢荧光素二酯酸（DCFH-DA）混匀，置37℃水浴0～30 min，洗涤和溶血，流式细胞术检测产生ROS的PMN为活化PMN，计算活化PMN的比率，以及检测活化PMN的平均荧光强度计算ROS产生量。
　　8.用荧光素二醋酸酯（FDA）标记M.tb，流式细胞术检测FDA标记率；取健康成人外周血与FDA标记的M.tb于37℃孵育20 min，洗涤溶血，加入自体血清，置37℃孵育0～60 min，流式细胞术检测标记M.tb的FDA的荧光强度减少计算PMN对M.tb的杀伤率。
　　结果:
　　1. M.tb用不同浓度FITC（10~40μg/ml）在PBS中标记的标记率从由85％增加到93%有显著性差异（p<0.01），MFI从326增加到517，也有显著性差异（p<0.01）；但M.tb用不同浓度FITC在CB中标记，标记率和MFI均无显著性差异。
　　2.人PMN与FITC标记M.tb在37℃水浴作用不同时间后，PMN的吞噬率随时间增加而增加（p<0.05），15 min吞噬率达到65％左右；15～20 min达到吞噬平台期。3.人PMN吞噬M.tb20 min，抗酸染色观察PMN内有大量的红色索状M.tb。
　　4.人PMN用抗人CD16-PE染色，吞噬FITC标记M.tb20 min，用激光共聚焦显微镜观察，发现着红色的PMN内有发绿色荧光的M.tb存在。
　　5.用不同浓度IL-2（5~160 U/ml）预处理人PMN2h后，发现PMN5 min吞噬百分率与对照组比较在40 U/ml时开始增加，且随浓度增加吞噬率增高（p<0.05），160 U/ml吞噬率较对照组增加77%。不同浓度IFN-γ（50~800U/ml）预处理人PMN2 h，吞噬率随浓度增加而增高（p<0.01），100 U/ml时吞噬增加率即可达到60%。不同浓度IL-12（10~240 U/ml）预处理人PMN2 h，发现吞噬率随浓度增加而增高（p<0.01），240 U/ml时吞噬增加率最高可达到79%。
　　6.不同浓度IL-4（10~200U/ml）预处理人PMN2 h后，发现PMN5 min吞噬百分率与对照组比较在200 U/ml时降低了31%，15 min吞噬百分率在50 U/ml时降低14%，随浓度增加吞噬率降低（p<0.05），200 U/ml吞噬降低率达32%。不同浓度GM-CSF（10~200 U/ml）预处理人PMN2h后， PMN吞噬M.tb5 min和15 min吞噬百分率和对照组相比较，差异无统计学意义（p>0.05）。
　　7.人PMN与M.tb在37℃水浴作用不同时间后，产生ROS的活化PMN随时间增加而增加（p<0.05），15 min活化率达到72％左右，15～30 min达到平台期，同时活化PMN产生的ROS量也随时间增加而增加（p<0.05）。
　　8.人PMN吞噬FDA标记M.tb20min后，流式细胞术检测PMN对M.tb0～60 min杀伤率，结果显示，PMN在吞噬M.tb20min后对M.tb30min和60min的杀伤率分别为16%和26%，杀伤率随时间增加而增加。
　　结论：
　　1. FITC浓度对M.tb标记率和MFI均有影响。
　　2.用流式细胞术可检测到人PMN对M.tb的吞噬活性，吞噬率随共孵育时间延长而增加，15～20 min达到吞噬平台期。
　　3. Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-12上调PMN吞噬M.tb功能，Th2型细胞因子IL-4下调PMN吞噬M.tb功能，表明这两型细胞因子在结核免疫中具有调节作用。
　　4. PMN吞噬M.tb后产生ROS的活化PMN的比率和释放ROS的量随时间延长而增加。
　　5.用流式细胞术和FDA标记法，可以检测出人外周血PMN对M.tb的杀伤活性，并发现杀伤活性随时间延长而增强。

目录

封面

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中文摘要

英文摘要

前言

材 料 和 方 法

1. 实验材料

2.实验方法

3. 统计学处理

结果

1. 人外周血PMN吞噬M.tb功能

2．人PMN吞噬M.tb活性氧（ROS）产生

3. 人外周血PMN杀伤M.tb功能

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A英文缩略词表

附录B常用试剂配制

附录C个人简历

附录D 综述: 中性粒细胞在结核感染中的作用