抑黄曲霉毒素的Hitwh-B05菌株有效成分的分离纯化与鉴定

摘要

黄曲霉毒素是一类由真菌代谢产生的有毒化合物,存在于土壤及花生、玉米等农作物中,不但对环境造成污染,人或动物若食用了受黄曲霉毒素污染的食品或饲料后会导致机体病变甚至死亡。因此,如何快速有效的抑制黄曲霉毒素对农作物、人畜及环境的污染是急需解决的问题,也是国内外学者研究的热点。本研究采用微生物源天然产物中具有抑黄曲霉毒素活性的物质作用于易感染农产品,提高农产品的防霉抑毒能力,从污染源头有效阻止霉菌侵染,减少毒素产生,为减少化学防腐剂对环境和人体的危害起到重要作用。
　　以本实验室分离获得的具有自主知识产权的枯草芽孢杆菌新菌株Hitwh-B05为主要研究对象,对其代谢产生的抑黄曲霉毒素有效成分的发酵条件进行优化;从多角度建立抑黄曲霉毒素有效成分的分离方法;对分离得到的抑黄曲霉毒素有效成分进行鉴定;初步探讨其抑制黄曲霉毒素产生的机制。本研究在国内率先采用tip culture方法研究枯草芽孢杆菌Hitwh-B05的抑黄曲霉毒素能力,其代谢产生的抑黄曲霉毒素有效成分能够有效抑制寄生曲霉菌丝生长及黄曲霉毒素合成途径中第一个稳定、且呈现橘红色的前体物质—Norsolorinic Acid(NA)的产生,进而抑制了黄曲霉毒素的产生,并且对黄曲霉毒素的抑制具有广谱性。Tip culture方法特点是直观,操作简单,实验周期短,能够进行定量分析,研究结果更准确可靠。与以往使用的产黄曲霉毒素菌株相比,无毒害作用,减少了对实验人员的危害和对环境的污染。
　　利用统计学方法优化了 Hitwh-B05菌株抑黄曲霉毒素有效成分产生的条件,使其产量得到显著提高。抑黄曲霉毒素有效成分产生的适宜条件为温度35℃、培养时间6d、培养基初始pH值为6.00,培养基配方为硫酸锰0.04g/L、酵母粉10g/L、牛肉膏12g/L、葡萄糖40g/L、大豆蛋白胨10g/L、硫酸镁4g/L、磷酸氢二钾4g/L。使用优化培养基获得的Hitwh-B05菌株发酵上清液对NA积累的抑制率是优化前的GY液体培养基的2.98倍,对菌丝体生长的抑制率是优化前的GY液体培养基的5.21倍,菌株代谢产生的脂肽产量是优化前的GY液体培养基的2.16倍。
　　大孔树脂富集法可作为实际生产应用中快速有效的分离枯草芽孢杆菌Hitwh-B05代谢产生的抑黄曲霉毒素有效成分的方法。筛选出大孔弱极性树脂DM130能够吸附大量抑黄曲霉毒素有效成分且不易吸收色素杂质,有效成分总回收率达到69.43％,色素去除率在96%以上。
　　通过分子生物学手段鉴定 Hitwh-B05菌株含有的脂肽编码基因合成的脂肽包括bacillomycin、bacilysin、ericin、fengycin、mersacidin、mycosubntilin、iturin A、surfactin和sublancin,表明Hitwh-B05菌株在适宜的条件下可产生的脂肽种类比较广泛。MALDI/TOF/MS分析Hitwh-B05菌株发酵上清液分离得到的抑黄曲霉毒素有效成分主要为脂肽类物质 iturin A、bacillomycin D、surfactin和fengycin A。结果表明枯草芽孢杆菌Hitwh-B05产生的脂肽种类比较广泛,国内外相关研究报道中,通过MALDI/TOF/MS方法在同一菌株中同时检测到4种不同种类的脂肽鲜有报道,多数仅检测到了1~3种脂肽。
　　Hitwh-B05菌株分离得到的抑黄曲霉毒素有效成分抗寄生曲霉侵染花生能力显著高于常用的化学合成防腐剂双乙酸钠(SDA),具有较大的应用潜力,为开发具有我国自主知识产权的、并能够有效抑制黄曲霉毒素合成的生物新农药提供理论和技术支持,使我国农产品的利用更加优质可靠。在抑黄曲霉毒素有效成分作用下,寄生曲霉孢子延迟萌发,菌丝体出现较多分节,干瘪、表面粗糙、失水严重,并且断裂成碎片。原因可能是在抑黄曲霉毒素有效成分作用下,寄生曲霉细胞膜中的磷脂双分子层产生孔隙,细胞膜结构被破坏而破裂,细胞无法正常吸收营养物质,导致菌丝体断裂,影响黄曲霉毒素合成。

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第1章 绪 论

1.1课题背景

1.2黄曲霉毒素的性质

1.3黄曲霉毒素去除技术

1.4微生物活性物质分离技术

1.5生物质谱技术的发展

1.6本课题研究目的及主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1实验材料与仪器设备

2.2寄生曲霉孢子制备及有效成分抑黄曲霉毒素能力检测方法

2.3 Hitwh-B05菌株发酵条件及培养基优化

2.4抑黄曲霉毒素有效成分分离纯化

2.5抑黄曲霉毒素有效成分鉴定

2.6抑黄曲霉毒素有效成分抑制黄曲霉毒素产生作用机制

第3章 Hitwh-B05菌株发酵条件优化

3.1引言

3.2 Hitwh-B05菌株发酵条件及培养基成分筛选

3.3 Hitwh-B05菌株培养基配方优化

3.4发酵罐培养

3.5本章小结

第4章 抑黄曲霉毒素有效成分分离纯化

4.1引言

4.2抑黄曲霉毒素有效成分高效液相色谱分离纯化

4.3大孔树脂法富集抑黄曲霉毒素有效成分

4.4抑黄曲霉毒素有效成分凝胶纯化

4.5抑黄曲霉毒素有效成分抗寄生曲霉侵染花生实验

4.6本章小结

第5章 抑黄曲霉毒素有效成分鉴定及抑制机制分析

5.1引言

5.2抑黄曲霉毒素有效成分的鉴定

5.3抑黄曲霉毒素有效成分的编码基因分子鉴定

5.4抑黄曲霉毒素有效成分抑制机制分析

5.5本章小结

结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

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致谢

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