南极海冰细菌Pseudoalteromonassp.的Trx与TrxR基因克隆、表达及特性分析

摘要

硫氧还蛋白系统是生物体内重要的抗氧化系统之一,主要包含有硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和NADPH,该系统通过调节酶活性、转录因子、各种胁迫应答和信号传导等,在生物抗逆系统中起着重要的作用。南极由于其独有的地理及气候特征,形成了一个干燥、酷寒、强辐射的自然环境,蕴育了丰富的微生物资源。在长期的进化和生长过程中,微生物形成了极为独特的基因资源、遗传背景及新的代谢特征。本论文以南极海冰细菌Pseudoalteromonassp.为材料,对硫氧还蛋白系统中两个重要成员Trx与TrxR的基因进行了克隆、异源表达以及活性研究,以期进一步完善南极微生物低温适应性的分子机制,获得具有自主知识产权的功能基因,为抗逆生物遗传育种提供新的基因。
　　(1)在前期从海冰细菌Pseudoalteromonassp.ANT178中克隆出Trx全长基因(PsTrx)的基础上,本论文利用生物信息学方法对PsTrx进行了分析和预测。该基因大小为327bp,编码108个氨基酸,理论分子量为11.9kDa,等电点pI=4.50,推测其关键活性位点为Cys33和Cys36,结构模型中含4个α-螺旋和5个β-折叠。将PsTrx基因转入E.coliBL21中,实现了异源表达,并对该重组蛋白进行了Ni-亲和层析纯化及活性测定。结果表明,经纯化后的Trx重组蛋白比活力为96.67U/mg,纯化倍数达22.22倍,总回收率为27.26％;其最适反应温度为25℃,最适反应pH为7.0。PsTrx在高盐(2MNaCl)环境中仍保留一定的活性。变性剂SDS对蛋白活性的抑制力最强,相对活性仅为22.94%,氧化剂H2O2对PsTrx的抑制作用最小,相对活性可高达95.36%。
　　(2)PsTrx基因转入E.coliBL21后,重组菌株耐盐性显著提高,在盐度为9%培养条件下,其最大OD600吸光值可以达到1.316,而野生型大肠杆菌的OD600仅为0.393。利用FQ-PCR相对定量2-△△Ct法测定不同盐度下海冰细菌PsTrx表达情况,高盐度下(5%-9%NaCl)的PsTrx表达量高于对照组(3.3%NaCl),其中9%盐度下的表达量是对照组的2.5倍,这表明PsTrx基因在菌体的耐盐机制中起着重要作用,进而可为耐盐遗传育种提供新的基因。
　　(3)从菌株Pseudoalteromonassp.ANT178克隆出TrxR基因,命名为PsTrxR,该基因具有完整的基因阅读框,大小为951bp。生物信息学分析表明该基因编码316个氨基酸,PsTrxR的理论分子量为33.7kDa,等电点为4.98,推断的活性位点为Cys136和Cys139,蛋白结构内含5个α-螺旋和18个β-折叠。将PsTrxR转入E.coliBL21中成功表达,利用Ni-亲和层析对重组蛋白进行纯化,重组蛋白比活力为29.71U/mg,总纯化倍数达26.29倍,总回收率为35.75%。重组PsTrxR的最适反应温度为20℃,最适反应pH为7.0,该酶在50℃处理40min后,酶活性下降至66%。以DTNB为底物测定酶动力学参数Km和Vmax分别为1.15mM和5.17nmol/mL/min。变性剂DTT对PsTrxR酶活的抑制作用为100%,金属离子Zn2+对酶的抑制作用小,相对剩余活性可达71.38%。

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第1章 绪 论

1.1 课题来源及目的意义

1.2 课题背景

1.3 硫氧还蛋白系统的研究与利用现状

1.3.1 硫氧还蛋白系统

1.3.2 Trx分类及其分布

1.3.3 Trx的生物学活性

1.3.4 TrxR分类与分布

1.3.5 TrxR的生物学功能

1.4 南极微生物的研究现状

1.5 研究的主要内容

第2章 Pseudoalteromonas sp.ANT178 Trx特性研究

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 培养基及配制

2.2 方法

2.2.1 PsTrx基因序列的生物信息学分析

2.2.2 PsTrx异源表达与分离纯化

2.2.3 Trx活性的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 PsTrx基因序列生物信息学分析结果

2.3.2 PsTrx异源表达蛋白的分离纯化

2.3.3 温度对蛋白活性的影响

2.3.4 温度对蛋白稳定性的影响

2.3.5 pH对蛋白活性的影响

2.3.6 盐度对蛋白活性的影响

2.3.7 抑制剂和金属离子对PsTrx活性的影响

2.4 本章小结

第3章 不同盐度对PsTrx表达影响的研究

3.1 材料

3.1.1 菌种来源

3.1.2 主要分子生物学试剂及器材

3.1.3 试剂及其配制

3.2 方法

3.2.1 PsTrx阳性重组菌耐盐生长状况的测定

3.2.2 FQ-PCR实验用品的预处理

3.2.3 菌株培养及其收集

3.2.4 总mRNA的提取

3.2.5去除DNA基因组及反转录cDNA的合成

3.2.6 实时荧光定量PCR引物的设计与合成

3.2.7 普通PCR对反转录产物进行验证

3.2.8 实时荧光定量PCR反应

3.3结果与讨论

3.3.1 PsTrx重组菌的耐盐生长状况

3.3.2 RNA提取及普通PCR验证

3.3.3 FQ-PCR反应产物的溶解曲线分析

3.3.4 FQ-PCR测定PsTrx基因表达特征分析

3.4 本章小结

第4章 PsTrxR基因的克隆、表达及酶学特性分析

4.1 材料

4.1.1 菌株材料

4.2 方法

4.2.1 活化菌株

4.2.2 菌体基因组的提取及鉴定

4.2.3 设计引物

4.2.4 PCR扩增及基因测序

4.2.5 PsTrxR基因序列的生物信息学分析

4.2.6 PCR产物的纯化

4.2.7 PsTrxR基因的表达

4.2.8 PsTrxR融合蛋白的纯化

4.2.9 PsTrxR酶学性质研究

4.3 结果与讨论

4.3.1 PsTrxR基因的克隆

4.3.2 基因序列生物信息学分析结果

4.3.3 PsTrxR异源表达载体的构建

4.3.4 PsTrxR重组蛋白的纯化

4.3.5 温度对酶活性的影响

4.3.6 温度对酶稳定性的影响

4.3.7 pH对酶活性的影响

4.3.8 盐度对酶活性的影响

4.3.9 抑制剂和金属离子对酶活性的影响

4.3.10 酶动力学参数的计算

4.4 本章小结

结论

参考文献

声明

致谢