山荆子多酚分离鉴定及对γ辐射诱导氧化损伤的防护作用

摘要

电离辐射能够诱导机体产生氧化应激反应，破坏机体的内环境稳态，造成机体的抗氧化防御系统、免疫系统及胃肠功能等的严重损伤，甚至导致遗传突变及引发癌症。因此，寻找能够降低氧化损伤、提升免疫活性，且高效无毒的天然辐射防护物质成为研究热点。本论文以山荆子多酚（Polyphenols from Malus baccata(Linn.) Borkh.，MBP）作为研究对象，采用不同溶剂进行分离并获得抗氧化活性最优组分丙酮提取物MBP-3，对其分离及纯化工艺进行研究，并对活性最强的梯度40％乙醇洗脱物MBP-3b进行组成分析及结构鉴定；系统的研究了MBP-3b对辐射诱导机体氧化损伤的防护作用途径及作用机制。
　　采用四种不同极性的溶剂（水、乙醇、丙酮和乙酸乙酯）分别提取获得山荆子多酚MBP-1~4四个组分，对多酚类化合物含量进行分析，并在体外建立不同抗氧化体系，研究 MBP的体外抗氧化活性和脂质过氧化抑制活性。结果表明山荆子丙酮提取物MBP-3的总酚、黄酮和花色苷含量最高；四种MBP均能不同程度的清除非生理性和生理性自由基，并具有显著的总还原能力及脂质过氧化抑制能力，其中MBP-3的抗氧化活性最为显著，说明MBP-3具有更有效的供电子及供氢能力，能够终止自由基链式反应、降低氧化应激从而抑制脂质过氧化的发生。
　　采用超声辅助提取方法分离山荆子多酚，通过响应面法优化得到山荆子多酚最佳提取工艺为：丙酮作为提取溶液，液料比13：1，提取温度47℃和超声功率330W，在最优条件下所得山荆子多酚含量为1170.45±28.15 mg GAE/100g；大孔树脂NKA-9层析纯化MBP-3最优条件为上样体积1/5 BV，上样流速1.5 BV/h，洗脱流速2.0 BV/h，动态梯度洗脱下40%（v/v）乙醇洗脱物MBP-3b总酚含量最高，且抗氧化活性最强。
　　采用UPLC-Q-TOF-MS，结合UV-Vis及FT-IR光谱对MBP-3b进行组成分析和结构鉴定，结果发现MBP-3b主要由十种多酚化合物组成，分别为飞燕草素3,5-二葡萄糖苷、矢车菊-3-葡萄糖苷、绿原酸、原花青素 C1、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-木糖苷/阿拉伯糖苷、根皮素-2-木糖葡萄糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷和根皮苷，相对质量百分含量分别为3.60%、9.29%、11.96%、1.64%、18.74%、6.63%、4.75%、7.16%、4.32%和18.24%。
　　在体外建立60Coγ辐射诱导脾细胞和外周血白细胞氧化损伤模型，通过对辐射后脾细胞的存活率、脾细胞内氧化还原状态、外周血白细胞形态、脾细胞DNA的损伤以及脾细胞内ROS的含量进行分析，结果发现MBP-3b能够显著的降低辐射后外周血中异形白细胞的数量，并能通过促进脾细胞内抗氧化酶SOD、CAT的活性，降低细胞内脂质过氧化产物MDA的产生，从而有效的抑制胞内ROS的生成，降低细胞的氧化应激反应的进程而抑制了DNA的损伤，提高了辐射条件下脾细胞存活率。
　　建立60Coγ辐射诱导小鼠氧化损伤模型，通过分析辐射后小鼠DNA损伤、免疫功能、抗氧化防御系统活性来研究MBP-3b对小鼠的辐射防护作用途径，结果发现，MBP-3b能够通过提高机体免疫功能，促进机体酶促（SOD、CAT、GSH-Px及GST）及非酶促（T-AOC、GSH）抗氧化防御系统功能，降低辐射后机体的脂质过氧化发生，从而有效抑制辐射后小鼠骨髓微核及染色体畸变的发生，对辐射诱导的小鼠机体氧化损伤具有防护作用。
　　通过对辐射条件下小鼠小肠及脾脏形态学及细胞凋亡进行研究，结果表明， MBP-3b能够缓解电离辐射诱导的小鼠小肠及脾脏组织病变，抑制免疫细胞的大量凋亡；通过免疫组化方法对小鼠脾细胞线粒体凋亡信号途径相关蛋白表达进行研究，结果表明MBP-3b能够有效抑制促凋亡Bax蛋白表达，促进抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达，从而抑制了细胞色素 c的释放及 Caspases-3活性亚基的表达，对辐射引起的脾细胞凋亡具有明显的抑制作用。
　　本课题研究表明山荆子多酚MBP-3b作为一种抗氧化组分，能够有效的促进机体酶促及非酶抗氧化防御系统功能，抑制60Coγ辐射诱导的活性氧的过量产生，调控线粒体凋亡信号途径相关蛋白表达，对辐射诱导的机体氧化损伤具有防护作用。本研究对于进一步揭示多酚类化合物的辐射防护作用机制、开发天然辐射防护物质具有理论和现实意义。

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第1章 绪 论

1.1 研究背景及目的和意义

1.2 多酚的类型与结构特征

1.3 多酚的生物活性

1.4 多酚的分离纯化及结构鉴定

1.5 辐射损伤及辐射防护剂

1.6 山荆子活性成分与生理功能研究进展

1.7 本论文的主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料与仪器设备

2.2 山荆子多酚的制备及纯化

2.3 MBP-3b的结构鉴定

2.4 山荆子多酚的生物活性研究

2.5 统计分析

第3章 不同提取溶剂对山荆子多酚含量及体外抗氧化活性影响

3.1 引言

3.2 山荆子不同溶剂提取组分抗氧化成分分析

3.3 MBP对非生理性自由基的清除活性

3.4 MBP对生理性自由基的清除活性

3.5 MBP的总还原能力

3.6 MBP对脂质过氧化（LPO）抑制活性

3.7 不同溶剂提取物抗氧化活性比较

3.8 本章小结

第4章 MBP的分离纯化及结构鉴定

4.1 引言

4.2 响应面法优化山荆子多酚提取工艺

4.3 大孔树脂对MBP-3的纯化

4.4 MBP-3层析分段组分抗氧化活性比较

4.5 MBP-3b组成分析及结构鉴定

4.6 本章小结

第5章 MBP-3b对辐射诱导细胞氧化损伤防护作用

5.1 引言

5.2 MBP-3b对脾细胞增殖作用

5.3 MBP-3b对辐射条件下脾细胞存活率的影响

5.4 相关性分析

5.5 MBP-3b对辐射条件下外周血白细胞氧化损伤的防护作用

5.6 MBP-3b对辐射条件下脾细胞内氧化还原状态影响

5.7 MBP-3b对辐射条件下脾细胞DNA的保护作用

5.8 MBP-3b对辐射条件下脾细胞内ROS的影响

5.9 本章小结

第6章 MBP-3b对辐射诱导小鼠氧化损伤防护作用

6.1 引言

6.2 MBP-3b对小鼠体重的影响

6.3 MBP-3b对辐射条件下小鼠DNA的影响

6.4 MBP-3b对辐射后小鼠机体免疫能力的影响

6.5 MBP-3b对辐射条件下小鼠内源性抗氧化状态的影响

6.6 MBP-3b对辐射条件下小鼠小肠及脾脏细胞凋亡的影响

6.7 MBP-3b对辐射条件下小鼠脾细胞周期的影响

6.8 MBP-3b对辐射诱导小鼠脾细胞凋亡相关蛋白表达的影响

6.9 MBP-3b对辐射诱导氧化损伤防护机制探讨

6.10 本章小结

结论

创新点

展望

参考文献

附录一

附录二

附录三

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢

个人简历