抗结肠癌功能益生菌筛选及其诱导HT-29细胞凋亡机制研究

摘要

结肠癌是威胁人类健康和生命的恶性疾病，其发病率和死亡率均很高。导致人结肠癌发病的原因很多，其中最重要的诱发因素是饮食。资料表明高脂肪、高蛋白和低纤维的饮食导致人结肠癌的发病率上升，而摄入益生菌对结肠癌有预防和抑制作用。但是，对于益生菌抑制结肠肿瘤的生长作用机理尚不十分清楚。
　　本论文以本实验室人员先前从中国西部地区传统发酵食品及婴儿、成人粪便中分离出的138株益生菌为供试菌株，以标准菌株 Lactobacillus rhamnosus GG（ATCC43121，USA）为阳性对照，采用MTT实验法初步筛选出活菌体具有显著抑制结肠癌HT-29细胞增殖能力的益生菌11株。又基于益生功能（包括黏附于肠上皮细胞能力、耐受模拟胃液和模拟肠液能力）对11株益生菌进行筛选，获得4株益生菌（M5、X11、X12和K14），其黏附能力、耐酸能力和耐胆盐能力显著高于阳性对照 LGG（P<0.05）。经16S rDNA种属鉴定，M5和X12属于副干酪乳杆菌，X11和K14属于干酪乳杆菌。
　　进一步对菌株M5、X11、X12和K14细胞壁和细胞质成分进行抗结肠癌能力筛选，同样以LGG菌株为阳性对照。通过MTT实验筛选出菌株M5、X11、X12、K14菌体细胞壁和M5、K14菌体细胞质具有显著抑制HT-29细胞增殖的能力（P<0.05）。继续对菌体成分进行诱导HT-29细胞凋亡能力实验，采用SCGE实验、DNA ladder实验、Annexin-V与PI染色、细胞周期分析、细胞膜电势检测、透射电镜观察细胞形态等凋亡指标进行筛选，最终获得菌株X12、M5和K14的细胞壁能显著诱导HT-29细胞DNA损伤和凋亡（P<0.05），而其对正常细胞（Vero）毒性作用很小，显著低于结肠癌HT-29细胞（P<0.05）。
　　以菌株X12、M5和K14细胞壁肽聚糖为研究目标，检测其抑制HT-29细胞增殖的能力。以5-Fu为阳性对照，通过MTT和TBE实验确定菌株X12和M5肽聚糖具有抑制HT-29细胞增殖的能力（P<0.05）。SDS-PAGE分析证实了X12和M5肽聚糖的存在，其分子量均约为14.4 kDa。通过对X12和M5肽聚糖氨基酸组分分析发现，其基本氨基酸组成为丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和赖氨酸。电镜观察显示X12和M5细胞壁肽聚糖保留了原菌体细胞的骨架结构。经过Annexin-V与PI染色分析和细胞周期分析，确定了X12和M5细胞壁肽聚糖可诱导HT-29细胞凋亡。
　　最后，对X12和M5肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡途径进行研究。流式细胞仪分析结果显示，肽聚糖降低了HT-29细胞线粒体膜电势（?m），并诱导胞内活性氧（ROS）的堆积。相对于阴性对照组，80μg/mL和160μg/mL的M5肽聚糖组△?m分别下降了13.63％和16.23%；而80μg/mL和160μg/mL的X12肽聚糖组则分别下降了27.79%和30.60%。M5肽聚糖诱导胞内ROS堆积的最佳剂量为160μg/mL，比阴性对照高了42.10%；而X12肽聚糖诱导胞内ROS堆积的最佳剂量是320μg/mL，比阴性对照高了近66.71%。ELISA实验结果显示，X12和M5肽聚糖均促进了HT-29细胞色素C（Cyto-C）从线粒体释放到胞浆中。RT-PCR实验结果显示，X12和M5肽聚糖上调HT-29细胞促凋亡基因Bax和Bad的mRNA表达，下调抗凋亡基因Bcl-xl的mRNA表达，并激活了Caspase-3，而且其诱导作用在本研究剂量范围内呈剂量依赖性关系。另外，Western blot实验结果也显示，X12肽聚糖上调了HT-29细胞Bax蛋白表达，下调了Bcl-2蛋白表达，促进无活性的Procaspase-3（32 kDa）转变成有活性的Caspase-3。同样，X12和M5的肽聚糖对正常细胞（Vero）没有毒性效应。
　　总之，本论文通过各项抑癌指标的筛选，最终获得具有抑癌功效的益生菌X12和M5肽聚糖，并表明益生菌肽聚糖可呈剂量依赖性地诱导HT-29细胞凋亡，其诱导细胞凋亡是通过凋亡线粒体途径来实现的。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究目的和意义

1.2 人结肠癌的发病原因

1.3 益生菌抗结肠癌功能研究进展

1.4 益生菌与线粒体凋亡信号通路

1.5 课题来源及主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 测定方法

2.3 实验方法

2.4 数据处理及统计分析

第3章 抗结肠癌功能益生菌的初步筛选

3.1 引言

3.2 益生菌菌株来源

3.3 基于抑制HT-29细胞增殖能力筛选抗结肠癌益生菌

3.4 基于益生菌的益生功能筛选抗结肠癌益生菌

3.5 益生菌菌种鉴定

3.6 本章小结

第4章 抗结肠癌功能益生菌菌体成分的筛选

4.1 引言

4.2 益生菌细胞壁和细胞质的提取及蛋白含量测定

4.3 基于抑制HT-29细胞增殖能力筛选益生菌菌体成分

4.4 基于诱导HT-29细胞DNA损伤筛选益生菌菌体成分

4.5 基于诱导HT-29细胞凋亡筛选益生菌菌体成分

4.6 益生菌细胞壁对正常细胞毒性影响

4.7 本章小结

第5章 益生菌肽聚糖对HT-29细胞抑制作用

5.1 引言

5.2 益生菌肽聚糖对HT-29细胞增殖的抑制

5.3 益生菌肽聚糖理化性质分析

5.4 益生菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡

5.5 益生菌X12和M5肽聚糖对正常细胞毒性影响

5.6 本章小结

第6章 益生菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡途径研究

6.1 引言

6.2 HT-29细胞总RNA的提取

6.3 益生菌肽聚糖对HT-29细胞凋亡相关基因的影响

6.4 益生菌肽聚糖诱导HT-29细胞线粒体膜电位的损失

6.5 益生菌肽聚糖诱导HT-29细胞ROS的堆积

6.6 益生菌肽聚糖诱导HT-29细胞线粒体Cyto-C的释放

6.7 益生菌X12肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡相关蛋白的变化

6.8 本章小结

结论

创新点

展望

参考文献

附录一

附录二

附录三

附录四

附录五

攻读博士学位期间发表的论文

声明

致谢

个人简历