黛矾散对雌激素诱导肝内胆汁淤积大鼠肝细胞膜影响的实验研究

摘要

目的肝内胆汁淤积(intrahapticcholistasis，IC)是许多肝病的共有的基础病变，其病因包括感染、药物、妊娠、酒精、自身免疫、手术、遗传等多种因素。近年来，随着口服避孕药及雌激素替代疗法的应用，雌激素诱导的肝内胆汁淤积发病率有增高的趋势。国外对肝内胆汁淤积症发病机制的研究已深入分子水平，但在治疗方面，除最近推崇的胆石溶石药熊去氧胆酸(UDCA)外，尚缺乏有效的治疗药物。我国有关肝内胆汁淤积的研究正处于起步阶段，西药研究滞后，而中药治疗已初见成效，并显现出一定的优势和特色。但有关中药治疗方面的研究多为临床研究，且多限于改善症状的观察，缺乏确切的科学实验依据。临床观察证实，黛矾散对病毒性肝炎、胆道疾患、妊娠等引起的胆汁淤积有较好疗效，但缺乏实验印证。基于上述国内外研究现状，我们以苯甲酸雌二醇(EB)诱导的肝内胆汁淤积模型为基础，用拆方研究方法，观察中药黛矾散对肝内胆汁淤积模型大鼠肝功能、肝组织学及肝细胞超微结构变化、肝细胞膜流动性、肝匀浆及肝窦膜中Na+-K+-ATPase、Mg++-ATPase活性的影响，探讨黛矾散治疗肝内胆汁淤的药物作用靶点和可能作用机制，从而为中医药治疗肝内胆汁淤积症提供科学依据，为寻求治疗肝内胆汁淤积的有效药物研究打下基础。 方法1、雄性Wistar大白鼠30只，体重280-320g，随机分为5组，每组6只，分别为正常组(A)、模型组(B)、明矾组(C)、青黛组(D)及黛矾散组(E)。B、C、D、E等四组分别以EB橄榄油皮下注射(11mg/kg.d)，连续3d进行造成肝内胆汁淤积模型。 2、观察实验动物小便颜色、毛色、饮食量和活动情况；取各组大鼠肝脏，用4％甲醛常规固定，制成石腊切片，进行HE常规染色，光学显微镜下观察肝脏取肝组织学变化；超薄切片机切片，醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色，透视电子显微镜观察肝细胞超微结构变化。 3、分离血清，常规生化检测各组实验大鼠血清总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBiL)、ALT、ALP、总胆固醇(Tch)的变化。 4、采用DPH荧光探针技术，用荧光偏振度测定及微黏度的计算的方法，测定肝细胞亚膜(窦膜和毛细胆管膜)流动性的变化。 5、取肝组织进行匀浆，分离毛细胆管膜和肝细胞窦膜，分别检测肝匀浆和毛细胆管膜中ALP水平，检测肝匀浆及肝窦膜中Na+-K+-ATPase、Mg++-ATPase活性。 结果1、一般观察可见，经EB皮下注射，模型组动物小便污染的白色草纸颜色黄染，黄色明显较正常对照组为深。饮食量和活动明显减少，毛色欠光泽。其他组草纸颜色亦较正常对照组为深，但较模型组对为浅；肉眼观察可见，模型组肝脏肿胀，包膜紧张，边缘钝厚，色泽暗红，有的呈颗粒状；光镜下观察，肝细胞肿胀，空泡样变性，部分肝细胞水肿，细胞质疏松，尤以肝小叶周围带更为明显，少有点状肝细胞坏死，伴有炎性细胞浸润，肝血窦变窄。除青黛组有1只大鼠肝细胞仍有轻度肿胀外，明矾组、青黛组及黛矾散组病理改变已基本恢复正常结构；电镜下观察，模型组肝细胞核内异染色质分布异常，滑面内质网增多，并呈不同程度扩张，线粒体肿胀，嵴断裂或消失，胞质出现空泡，少数出现膜退形性变，双核及多核的枯否氏细胞增多。部分毛细胆管扩张，扩张的毛细胆管中见微绒毛变短排列紊乱，胆小管内见电子密度高的无定形物，可能为胆汁淤积。明矾组、青黛组及黛矾散组除少数大鼠肝细胞仍有轻度肿胀，滑面内质网轻度扩张、支架塌陷外，大部分大鼠肝细胞超微结构均基本恢复正常。 2、肝功能检测：模型组动物血清总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBiL)、及ALT、ALP均有明显升高(P＜0.05)，总胆固醇(Tch)明显下降(P＜0.05)；黛矾散组和明矾组TBA、TBiL、ALT及ALP明显下降，Tch回升，与模型组比较差异显著(P＜0.05)；青黛组在Tch上升、ALP下降，与模型组比较差异显著(P＜0.05)。 3、细胞膜流动性测定：模型组动物肝细胞窦膜和毛细胆管膜的微黏度(η)明显增高，与正常对照组比较，差异有显著意义(P＜0.05)。与之相对应的F值明显降低，即膜流动性明显降低。而经口投予黛矾散及其组分明矾和青黛处理后，肝细胞窦膜和毛细胆管膜微黏度明显降低，其中以黛矾散组降低最为显著，明矾组次之，青黛组下降幅度最小，与模型组比较，差别均有显著意义(P＜0.05)，相对应的F值则明显升高。 4、肝细胞膜系统ALP、Na+-K+-ATPase和Mg++-ATPase检测：模型组大鼠肝匀浆及窦膜中，ALP活性水平较正常组均明显升高(P＜0.05)，而窦膜中ALP的水平又显著高于肝匀浆；在肝匀浆中，明矾组和黛矾散组ALP明显低于模型组(P＜0.05)；在毛细胆管胆中，明矾组、青黛组和黛矾散组ALP均明显低于模型组(P＜0.05)。模型组大鼠肝匀浆及窦膜中，Na+-K+-ATPase和Mg++-ATPase活性水平较正常组均明显减低(P＜0.05)，窦膜中两酶的水平又显著高于肝匀浆；在肝匀浆中，明矾组和青黛组Na+-K+-ATPase水平明显高于模型组(P＜0.05)；而在窦膜中明矾组、青黛组和黛矾散组均明显高于模型组(P＜0.05)；在肝匀浆及窦膜中，明矾组、青黛组和黛矾散组Mg++-ATPase活性均明显高于模型组(P＜0.05)。 结论上述实验结果表明：雌激素苯甲酸雌二醇(EB)，引起肝损伤、肝功能损害，肝细胞超微结构的变化、肝细胞膜流动性的降低，导致膜上各种转运载体如Na+-K+-ATP、Mg++-ATP酶的活性下降，从而使细胞分泌胆汁障碍，影响毛细胆管胆汁流和胆盐分泌速率，并最终形成肝内胆汁淤积症。这可能是雌激素导致肝内胆汁淤积的发病学机制之一。 同时，实验结果提示：经口给予黛矾散及其组份明矾和青黛，可对抗EB引起的肝损伤、肝功能损害，肝细胞超微结构的变化、肝细胞膜流动性的降低和Na+-K+-ATP、Mg++-ATP酶的活性下降，对雌激素导致的肝内胆汁淤积具有明确的防治作用，且明矾和青黛有协同作用，而明矾的作用又优于青黛。依据上述实验结果，结合雌激素性肝内胆汁淤积发病机制，可以认为，中药黛矾散治疗肝内胆汁淤积症的作用机理可能是通过以下途径实现的：①减轻肝组织病变损伤，维持肝细胞正常的超微结构和功能；②维护肝细胞膜的流动性；③增强肝细胞膜及亚膜上各种转运载体如Na+-K+-ATP、Mg++-ATP酶活性，而细胞膜及亚膜上各种转运载体可能是药物作用的主要靶点之一。

目录

郑重声明

英文缩略词表（按字母顺序排列）

前言

实验一黛矾散对雌激素诱导肝内胆汁淤积大鼠的肝功能及肝组织结构的影响

实验二黛矾散对雌激素诱导的大鼠肝内胆汁淤积细胞膜流动性的影响

实验三黛矾散对雌激素诱导肝内胆汁淤积大鼠的ALP、Na+-K+-ATPase和Mg++-ATPase的影响

讨论与结语

文献综述一雌激素性肝内胆汁淤积发病机制的研究进展

文献综述二肝内胆汁淤积的中医药研究进展

在校期间发表论文及申报课题情况

致谢

附图