丹黄方对急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的实验研究

摘要

目的：(1)探讨丹黄方对硫代乙酰胺所致急性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的作用及机制。 (2)探讨丹黄方对部分肝切除大鼠肝再生的作用及机制。 方法：(1)113只Wistar大鼠，雄性56只，雌性57只，体重230～250g，随机分为6组：正常对照组(8只)、急性肝衰竭组(25只)、丹黄方大剂量组(20只)、丹黄方中剂量组(20只)、丹黄方小剂量组(20只)、促肝细胞生长素组(20只)。试验第2天除正常对照组皮下注射同等剂量的生理盐水外，其余各组用TAA600mg/kg-1体重皮下注射造模，24h后相同剂量重复注射1次。试验开始至实验结束，正常组、急性肝衰竭模型组、促肝细胞生长素组予生理盐水5ml·kg-1灌胃，丹黄方大、中、小剂量组分别给等体积/重量比的相应药物灌胃(三组分别给予丹黄方成人等效剂量、成人等效剂量的5倍、成人等效剂量的10倍剂量进行灌胃)；除正常对照组外所有动物每日皮下注射5ml混合液(10％葡萄糖3ml、含适量生理盐水与20μmol/LKCl2ml)以防低血糖，促肝细胞生长素组予促肝细胞生长素2mg/kg体重溶于上述防止低血糖的混合液中，每日皮下注射1次，持续3d，观察造模后48h内大鼠病死率。并于第2次注射TAA后24h后腹主动脉采血测定肝功能(ALT、AST、TB)，ABC-ELISA法检测血清TNF-α水平。迅速取肝组织，用10％甲醛液中固定，石蜡切片，检测肝组织病理变化及有丝分裂指数。用链霉菌抗生物素-过氧化酶法(SP法)检测增殖细胞核抗原、肝再生信号调节蛋白α1和白细胞分化抗原14。逆转录聚合酶链反应法检测白细胞分化抗原14mRNA的表达。 (2)雄性Wistar大鼠24只，体重230～250g，随机分为正常组(假手术对照组)、模型组(肝切除手术组)、丹黄组和pHGF组4组，每组6只。大鼠自由喂养1周后，术前12h禁食，6h禁饮。丹黄组和pHGF组于手术前3天至实验结束，每日1次分别腹腔注射生理盐水4.0ml·kg-1体重、灌胃丹黄方10g·kg-1体重、和灌胃生理盐水4.0ml·kg-1体重、腹腔注射pHGF1ml/100g，假手术对照组、肝切除手术组模型组分别给予腹腔注射0.85％生理盐水1ml/100g，同时两组分别灌胃等体积的生理盐水。按照Higgins和Panis等介绍方法无菌条件下操作。1％戊巴比妥钠(用量40mg/kg体重-1)皮下注入麻醉动物，固定在自制的简易手术台上，剪去上腹部鼠毛，体积分数为2％的碘酊消毒，体积分数为75％的乙醇脱碘，盖洞巾，在大鼠上腹部做一个纵形长约1cm的切口，拉出左叶和中叶，用手术线在左叶和中叶根部结扎，切除肝脏左叶和中叶(占70％)，术毕皮下给予生理盐水1ml，缝合刀口，消毒。假手术组动物仅开腹翻动肝左叶和中叶，不作肝叶切除，术后自由饮食水，所有动物无1例死亡。除正常组大鼠仅进行肝叶的牵拉，其余大鼠均进行70％肝叶切除复制模型。48h后，杀死动物，迅速取肝组织，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，逆转录聚合酶链反应法检测细胞癌基因fosmRNA、肝细胞生长因子mRNA、肝再生因子-1mRNA、神经生长因子诱导的抗增殖相关分泌蛋白mRNA、非受体型酪氨酸激酶mRNA和转化生长因子β1mRNA的表达。 结果：(1)丹黄方能明显降低急性肝衰竭大鼠死亡率、肝功能(ALT、AST、TB)及TNF-α水平，改善肝组织病变，与模型组及促肝细胞生长素阳性对照组比较，P＜0.05或P＜0.01，有显著差异。正常组大鼠肝组织MI、PCNA的表达水平较低，与模型组和pHGF组大鼠相比，差异显著(P＜0.01)。丹黄方治疗后，大鼠肝组织MI、PCNA的表达，各剂量组明显高于正常组(P＜0.01)，且随着丹黄方剂量的增而增加，丹黄中、大剂量组大鼠肝组织MI、PCNA的表达，与模型组相比，明显升高(P＜0.01)。正常组大鼠肝组织SIRPα1表达水平较低，模型组和促肝细胞生长素组大鼠与其相比，差异显著(P＜0.01)。丹黄方治疗后，大鼠肝组织SIRPα1的表达升高，丹黄方各剂量组SIRPα1的表达明显高于正常组(P＜0.01)，且随着丹黄方剂量的增加SIRPα1的表达增强，丹黄中、大剂量组大鼠肝组织SIRPα1的表达，与模型组相比，明显升高(P＜0.01)。丹黄方对TAA诱导的CD14表达有抑制作用，并呈剂量相关性。肝衰竭模型组CD14及CD14mRNA表达均较对照组显著增强，t值分别为5.861，8.417，P＜0.01，提示内毒素参与了肝衰竭的发生。经丹黄方治疗的肝衰竭大鼠，肝组织中CD14及CD14mRNA表达均较模型组显著减弱，t值分别为4.265，5.379，P＜0.01。而促肝细胞生长素组肝组织中CD14及CD14mRNA表达与模型组比较无显著变化，t=1.973，P＞0.05，提示促肝细胞生长素的促肝细胞再生作用于内毒素系统无关。 (2)丹黄方、pHGF均能促进HGFmRNA表达，与手术组比较，差异显著，t值分别为3.946、7.192，P＜0.05,P＜0.01；丹黄方的促进HGFmRNA表达作用较pHGF组弱，但无显著性差异，t=3.368，P＞0.05。丹黄方可显著促进TecmRNA表达，与手术组比较，t=10.08,P＜0.01；且丹黄方的促TecmRNA表达作用显著强于pHGF组，t=8.446,P＜0.01。与手术组比较，pHGF、丹黄方均能显著促进c-fosmRNA的表达，t值分别为2.458、2.746，均P＜0.05；丹黄方与pHGF组比较，无显著性差异，t=0.288,P＞0.05,提示二者在促进c-fosmRNA的表达方面无显著性差异。丹黄方能促进肝再生模型大鼠肝组织PC3mRNA，与手术组比较t=2.972,P＜0.01；与pHGF组比较无显著差异，t=0.102，P＞0.05。在LRF-1mRNA表达方面，各组间无显著差异，提示丹黄方对LRF-1mRNA表达影响不显著。手术部分切除肝组织后，TGF-β1mRNA水平较假手术组显著升高,t=2.698,P＜0.05；与手术组比较，丹黄方、pHGF均能在一定程度上降低TGF-β1mRNA表达，但无显著性差异，t值分别为0.909、0.304，均P＞0.05。 结论：(1)丹黄方能明显降低急性肝衰竭大鼠死亡率、肝功能(ALT、AST、TB)及TNF-α水平，增强大鼠肝组织有丝分裂指数、增殖细胞核抗原、肝再生信号调节蛋白α1的表达，抑制CD14及CD14mRNA的表达，丹黄具有改善急性肝衰竭大鼠肝损伤的作用。 (2丹黄方明显促进肝再生大鼠HGFmRNA、TecmRNA、c-fosmRNA及PC3mRNA的表达，与模型组比较，有显著性差异(P＜0.01)；丹黄方可上调LRF-1mRNA的表达，下调TGF-β1mRNA的表达，与模型组比较，但无显著性差异(P＞0.05)。丹黄方具有促进大鼠肝再生的作用。

目录

郑重声明

英文缩略词表（按字母顺序排列）

前言

实验一丹黄方对硫代乙酰胺致大鼠急性肝衰竭的影响

实验二丹黄方对大鼠急性肝衰竭肝再生作用的实验研究

实验三丹黄方对大鼠急性肝衰竭肝再生过程中CD14的影响

实验四丹黄方对大鼠肝再生过程中HGF影响的实验研究

实验五丹黄方对大鼠肝再生过程中Tec影响的实验研究

实验六丹黄方对大鼠肝再生过程中PC3、c-fos、LRF-1影响的实验研究

实验七丹黄方对大鼠肝再生过程中TGF β1影响的实验研究

讨论

结语

参考文献

博士生期间发表论文、主持课题及科研奖励

文献综述

致谢