麝黄消瘤方抗肝癌细胞侵袭与转移作用的实验研究

摘要

目的:本课题在原有体内实验的基础上，继续研究麝黄消瘤方(SH方)在体外对肝癌细胞SMMC-7721侵袭黏附能力的影响及其可能的作用机制。重点探讨SH方对肝癌细胞与纤维连接蛋白(FN)侵袭黏附的抑制作用，及SH方对肝癌细胞内抑癌基因nm23-H1蛋白和细胞膜表面粘附分子(ICAM-1)表达的影响，以更好的为临床应用及新药开发提供客观科学的实验依据。 方法:(1)含药血清的制备麝黄消瘤方由丹参、白术、半枝莲、莪术等中药组成，经我院中药实验室水煎、浓缩、醇沉制成，临用时用PBS稀释成含生药2g/ml的中药液，雄性新西兰大白兔6只，体重2.5kg±0.1kg，分2组，每组3只，中药组予每只20ml/d中药液灌胃，对照组予PBS液每只20ml/d灌胃，连续5d，从第4d下午开始禁食，d5时先灌服半量，2h后再灌服余半量，再过1h后颈总动脉取血，无菌分离血清，经56℃30min灭活处理后，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，以中药兔血清，对照兔血清分别配成含血清10％的PRMI1640培养液，-20℃保存备用。 (2)细胞生长与细胞抑制率测定将2.5×104SMMC-7721肝癌细胞株分别接种于含10％中药兔血清和10％对照兔血清的1640培养基中，1～7天每天计数细胞浓度，绘制细胞生长曲线。1，3，5，7天均以相同细胞数4×103/孔接种96孔培养板，每组设3个复孔.MTT法计数1，3，5，7天的细胞数量，以光密度OD570nm表示。肿瘤细胞抑制率=(对照组平均OD570nm-中药组平均OD570nm)/对照组平均OD570nm×100％. (3)细胞膜表面ICAM-1表达测定细胞传代后换用中药兔血清和对照兔血清1640培养基分别培养72小时，以0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞制成悬液，离心，PBS洗涤，加入鼠抗人ICAM-1单抗30ul，冰上孵育30min后，加入FITC标记的羊抗鼠二抗20ul，4℃孵育30min。FACSCalibur流式细胞仪检测闪烁计数值。 (4)免疫组化法检测细胞nm23-H1水平的变化细胞涂片于6孔板中的玻璃片上，分别以中药血清与对照血清培养72小时，4％多聚甲醛固定，30％H2O2+纯甲醇灭活内源性过氧化物酶，BSA封闭，滴加1：200稀释一抗，再依次加二抗、SABC、DAB显色、苏木素轻度复染，脱水、透明、封片固定。用已知阳性染色的肝癌切片为每次实验的阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。 (5)肝癌细胞对FN的侵袭粘附试验将8MMC-7721细胞悬液接种于FN包被的6孔培养板上，用含10％小牛血清的1640培养至细胞长满后，在孔底刮出一条2mm宽的无细胞带，洗去多余的细胞，分别改用中药组血清和对照组血清培养，观察细胞生长状态，贴壁情况和刮痕宽度变化，记录12h、24h、36h时以上状况。 (6)MTT定量测定肝癌细胞与FN的粘附4×105/ml的细胞接种于FN包被的96孔培养板，100ul/孔，分别设中药血清，对照血清组培养，增设无细胞有药物组作阴性对照组。加入培液100ul/孔，每组设计4个复孔。置37℃，CO25％培养箱内培养，10min，20min，40min，60min时按时间分类组分别用PBS洗去未粘附的细胞，每孔加20ul的浓度为5mg/ml的MTT，置培养箱内4小时后，倾去液体，加入DMSO150ul/孔，在震荡仪上轻轻震荡使甲替颗粒融解为红紫色溶液，上酶标仪，光密度570nm处测OD值，OD值代替粘附细胞数作统计分析。 结果:(1)SMMC-7721细胞生长285繁殖力随时间变化是逐渐上升，在第4～6天最为明显。中药血清组较对照组明显抑制肝癌细胞的体外生长，1，3，5，7天平均抑制率分别为10.84％(p＞0.05)、35.97％(p＜0.01)、66.25％(p＜0.01)、30.20％(p＜0.05)，其中在第5天最突出，抑制率最高达66.25％； (2)在粘附分子-1的流式细胞仪检测中，对照组闪烁计数值共为1818.7，中药血清组数值为1027.7，相对对照组减少43.49％； (3)在中药血清组培养的SMMC-7721细胞，其抑癌基因nm23-H1阳性表达率为88.89％，对照组阳性率仅11.11％，表明中药血清组有显著提高抑癌基因表达的能力； (4)中药血清组细胞在FN包被的培养孔中粘附力较对照组低，在划痕处细胞分化脱落向无细胞带侵袭生长能力较对照组弱； (5)在细胞粘附力的测定中，中药血清组在10、20、40与60分钟的细胞粘附抑制率分别为20.45％、26.85％、44.78％与43.12％，中药血清组对SMMC-7721细胞在FN上的粘附抑制作用在中药组作用的后20分钟最为明显。 结论:(1)含SH方的血清可减缓肝癌细胞在培养液中的生长增殖； (2)SH方可抑制SMMC-7721细胞的侵袭粘附能力； (3)其作用机制与中药血清上调nm23-H1蛋白水平和降低ICAM-1的表达有关。

目录

郑重声明

摘要

附：英文缩略词说明

前言

实验研究

实验结果

讨论

参考文献

附图

综述中医药防治肝癌的研究进展

致谢