南极酵母AN5重金属Cu2+胁迫的转录组学研究

摘要

自然环境中存在着许多在重金属胁迫下能正常生长的微生物，如酵母菌、藻类和细菌等。微生物在去除重金属和适应环境的过程中，其细胞内部必定会发生一系列复杂的生理生化反应。本实验以南极酵母（Rhodotorula mucilaginosa） AN5为研究对象，通过 Illumina测序技术分析其在Cu2+胁迫下转录组学的变化，从mRNA水平研究南极酵母AN5对重金属的适应机制。对2个显著差异基因开展了进一步研究，包括 WD重复蛋白基因的克隆分析和表达纯化，以及谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及序列分析。
　　（1）利用转录组测序技术，对 Cu2+胁迫前后的南极酵母 AN5转录组进行了测序，对照组共得到41738378条读序，实验组得到51247104条读序。确认了407个表达差异（2倍变化以上）的基因，其中有305个基因表达上调，102个基因表达下调；通过 GO注释对基因进行分类，大部分的unigene被归于生物学过程；对6414条unigene进行了eggNOG分析，了解基因的功能分布特征；共有3282个isotig得到了KEGG注释，代谢通路所占比例较大，为32.3％，根据以上分析确认了大量与环境胁迫相关的差异表达基因。
　　（2）在表达差异显著的基因中选取3个基因进行荧光定量PCR实验，包括WD重复蛋白基因、谷胱甘肽硫转移酶基因、热激蛋白90基因。结果表明，在重金属Cu2+胁迫下，基因GST和WD重复蛋白的表达量均呈上调趋势，基因HSP90在4 h和12 h的表达量上调，48 h的表达量下调。GST基因在48 h时表达量显著提高，约是对照组的5倍；HSP90基因在12 h时实验组的表达量显著高于对照组。
　　（3）本实验对南极酵母AN5转录组测序得到的重要差异基因WD重复蛋白基因进行克隆，得到cDNA序列长度为1079 bp，共编码361个氨基酸。生物信息学分析结果表明，WD重复蛋白的分子量为40.91 kDa，理论等电点为5.25，主要表现为亲水性，即不存在跨膜区也检测不到信号肽序列。在其下游引入His Tag，重组到pET-28a载体上成功构建相应的表达载体，此外用IPTG对其进行诱导表达，并用亲和层析对目的蛋白进行了纯化。
　　（4）对南极酵母AN5的GST基因进行克隆和序列分析后发现，GST基因的cDNA长度为969 bp，编码氨基酸的数量为284个，蛋白的分子量为32.58 kDa，理论等电点为7.74，亲水性较强，既不存在明显的跨膜区也不是信号肽，二、三级结构预测结果表明该蛋白存在较多的α-螺旋和无规卷曲。
　　以上研究以期为理解南极酵母菌对重金属的抗性机制提供一些参考。

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第1章 绪 论

1.1 课题的意义及研究背景

1.2 微生物重金属抗性机制的研究

1.3 高通量测序技术

1.4 本研究的目的和主要内容

第2章 Cu2+胁迫下南极酵母AN5转录组学研究

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6 本章小结

第3章 WD重复蛋白基因的克隆表达及纯化

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

3.6 本章小结

第4章 GST基因克隆与生物信息学分析

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 本章小结

结论

参考文献

声明

致谢