针灸对环磷酰胺小鼠骨髓细胞DNA修复相关机制的动态研究

摘要

研究目的：化疗是现代癌症治疗的三大方法之一。由于多数化疗药物的作用靶点是细胞的DNA，其特异性不高，因此，在杀伤肿瘤细胞的同时，也破坏了机体的正常细胞(尤其是对增殖活跃的骨髓造血干细胞损伤明显)．受损伤的细胞DNA主要通过修复和凋亡，来保护其正常的生理功能和稳定的遗传性状．当细胞损伤严重时，细胞趋向凋亡；在损伤较轻时，细胞周期受阻、停滞，DNA修复系统启动。完成修复后，继续进入细胞周期[1]．由于骨髓是造血组织，一旦细胞周期受到干扰，就会产生骨髓抑制，造血功能低下，发生外周血白细胞减少，机体免疫功能降低，导致化疗失败或因感染死亡．在这个过程中，参与DNA修复的相关酶类和蛋白不仅与修复关系密切，而且通过作用于细胞周期进而影响骨髓的抑制程度。 根据化疗药物致骨髓损伤机制和细胞DNA修复研究进展并结合近20年来的研究工作基础，提出“促进骨髓造血细胞DNA修复，是针灸改善骨髓抑制、保护机体造血功能的关键”之假说．并以CTX损伤骨髓造血细胞DNA的主要位点为切入点，围绕DNA损伤修复的关键途径，通过观察针灸对CTX小鼠骨髓细胞DNA修复蛋白表达的动态影响以及细胞周期的变化，并对其之间的相关性及变化规律进行分析，从而揭示针灸减轻化疗不良反应，保护骨髓造血细胞，改善骨髓抑制新的分子生物学机制，也为针灸治疗病理性造血损伤相关疾病提供实验室依据。此外，通过比较分析，探讨针法与灸法在改善骨髓抑制中的作用环节差异。 研究方法： 分组：选用清洁级，雄性昆明种(KM)小鼠224只，体重22±2g。称量各小鼠体重后，根据体重将小鼠随机分到正常组、模型组、针刺组、艾灸组，即每组56只(8只/天×7天)×4组=224。 模型复制：依据《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》的造模方法，用环磷酰胺建立骨髓抑制小鼠模型。腹腔注射CTX100mg/kg/d(按照小鼠体重0.02ml/g用药量，腹腔注射浓度为5mg/ml的CTX溶液)，后分别在24h、48h再行CTX注射，即连续3d[8]，停药后4h模型即成(依据CTX药代动力学过程，4小时后药物活性消失[9])。正常组小鼠按照0.02ml/g用药量，注入0.9％注射生理盐水。 穴位选取及治疗：小鼠穴位定位参考《中国兽医针灸学》[10]，并模拟大鼠穴位定位法“大椎”位于第七颈椎与第一胸椎间，背部正中；“膈俞”位于第七胸椎下两旁，左右各一穴；“肾俞”在第二腰椎下两旁肋间，左右各一穴；“足三里”位于小鼠后肢膝关节后外侧，腓骨小头下约5mm处，左右各一穴[11]。 针刺组：按照造模时间的先后顺序，在造模完成后4h进行针刺，各组小鼠配对同时进行。选用华佗牌美容毫针，采用管式进针法直刺，进针深度为3mm，行捻转法5次，留针10min。每日1次，连续7天。 艾灸组：按照造模时间的先后顺序，在造模完成后4h进行艾灸，各组配对同时进行。用美容细艾条点燃后，在距离穴位皮肤5mm处悬灸3 min。每日1次，连续7天。 正常组：每日陪同针刺组、艾灸组抓取、固定，不做任何治疗。 模型组：每日陪同针刺组、艾灸组抓取、固定，不做任何治疗。 观察指标及方法： ①从小鼠注射CTX之前一直到CTX造模后，每天早上取血检测白细胞计数。方法是依次将4组小鼠割尾取血10 μl/只，分别依次滴入390 μl 3％冰乙酸稀释液的试管中，以备检测外周血白细胞计数。连续10天(造模3天，停药后7天)． ②从造模后第2天开始，每天针刺、艾灸4h后，取骨髓细胞制备成细胞悬液以测定骨髓细胞DNA含量以及各细胞周期百分率。方法是从各组小鼠中以随机法选取8只小鼠脱颈处死，取一侧的肱骨和股骨在超净工作台上，除净肌肉和结缔组织，经O.9％生理盐水冲洗——75％乙醇中浸泡2min——再用O．9％生理盐水中冲洗后，用无菌眼科小剪子上端剪口，用5ml注射器抽取3.6m1 0.9％生理盐水注入股骨骨髓腔，反复2-3遍冲洗其全部有核细胞，离散成单个细胞悬液，注入冻存管内密封好，再放入-80℃低温冰箱保存，以备用流氏细胞仪测定骨髓细胞DNA含量和各细胞周期骨髓细胞百分率，连续7天． 统计分析： 数据分析采用SPSS13.0 for Windows统计分析软件．计量资料数据以均数(-x)标准差(s)表示，各组问比较采用方差齐性检验，方差齐则采用单因素方差分析，方差不齐，先校正方差，再进行方差分析，检验标准取α-0.05。不服从正态分布者，采用非参数检验． 结果： 1.造模后CTX小鼠外周血白细胞计数的动态变化： 第1天，造模前各组基础白细胞计数差别不显著(P>0.05)．说明各组小鼠来自同一整体，白细胞计数分布均衡，可用于试验。第2天、第3天小鼠注射CTX后外周血白细胞逐渐下降，与正常组比模型组、针刺组、艾灸组白细胞均降低，有显著性差异(P<0.05)；与模型组比针刺组、艾灸组白细胞无显著性差异(P>0.05)。表明化疗药物CTX抑制骨髓造血功能，损伤造血细胞的毒副作用是非常明显的。 2.针灸对CTX小鼠外周血白细胞计数动态变化的影响： 与模型组比，针刺组和艾灸组可使CTX小鼠白细胞提前1天回升并提前1天超过基础水平．尤其在第4-7天针刺组、艾灸组白细胞均明显升高,表明针灸确有减轻CTX小鼠骨髓抑制，提升白细胞的作用．针刺与艾灸两种方法比较无显著差异． 3.针灸对CTX小鼠骨髓细胞ONA含量动态变化的影响： 研究结果显示，G1期与G2期的DNA含量总体变化趋势相同．CTX化疗后，与正常组比针刺组、艾灸组、模型组G1期和G2期DNA含量减少，说明CTX致造血系统受损．与模型组比，针刺组、艾灸组至第4天已高于模型组，第5天已有显著性差异。表明针刺和艾灸能够增加骨髓细胞DNA含量，促进骨髓细胞的分裂增殖。针刺发挥作用在时间上早于艾灸，在疗效上艾灸组虽优于针刺组，但无显著性差异． 4.针灸对CTX小鼠细胞周期动态变化的影响： 4.1针灸对CTX小鼠G1期动态变化的影响：针刺组、艾灸组第2-7天G1期骨髓细胞百分率始终低于模型组，提示针灸可以减轻G1期阻滞，降低G1/S期检测点的功能，使处于G1期阻留状态的部分细胞及时得到修复，促进骨髓细胞通过G1/S期检测点以进入S期进行DNA合成，继续分裂进行周期循环． 4.2针灸对CTX小鼠S期动态变化的影响：针刺组、艾灸组第2-7天S期骨髓细胞百分率始终高于模型组，且第2、3、4有显著差异，提示针刺和艾灸可以减轻化疗对细胞DNA的损伤，促进骨髓细胞DNA的修复和合成。 5.针灸对CTX小鼠骨髓细胞DNA修复蛋白表达动态变化的影响： 5.1针灸对CTX小鼠骨髓细胞Cyclin D1蛋白表达动态变化的影响：CTXR造模后小鼠骨髓细胞中细胞周期调控因子Cyclin D1表达降低，影响了细胞周期各期之间的顺序转换，尤其是G1/s的转换，抑制了细胞从G1期进入S期，使DNA合成减少．从第2天开始，针刺组、艾灸组均高于正常组和模型组，至第4天升至最高，与正常组和模型组比有显著差异(p<0.05)；在升至最高点的平均时程上，针刺组、艾灸组比模型组提前一天．Cyclin D1蛋白表达的升高与s期的细胞增殖时程相一致．第5天后虽然针刺组和艾灸组Cyclin D1表达逐渐下降，但仍显著高于正常组和模型组，呈周期性波动。表明针刺和艾灸可以上调Cyclin D1蛋白表达，并有周期性变化． 5.2针灸对CTX化疗小鼠骨髓细胞MGMT蛋白表达动态变化的影响：针刺组从第3天明显高于模型组，也高于艾灸组但无显著差异(P>0.05)；艾灸组第2天明显高于模型组(p<0.05)，针刺组、艾灸组分别于第5、6天升至最高；模型组虽然从第4天呈升高趋势，但均低于针刺组、艾灸组，且升至最高值仍低于针刺组、艾灸组． 结论： 1.针刺和艾灸改善CTX小鼠化疗后骨髓抑制，升高白细胞的效果确切，其作用随着治疗次数的增多而增强；外周血白细胞的变化与针灸上调骨髓细胞DNA修复蛋白的表达、加速细胞周期的进程，促进DNA合成和细胞增殖密切相关． 2.针刺和艾灸均可以升高CTX小鼠G2期与G1期骨髓细胞的DNA含量，提高骨髓细胞的增殖水平．针刺与艾灸比较无显著性差异． 3.针刺和艾灸可以促进骨髓细胞G1期通过G1/S期检测点以进入S期进行DNA合成，继续分裂进行周期循环。针刺与艾灸比较无显著性差异。 4.针刺和艾灸具有促进CTX小鼠骨髓细胞的修复和分裂增殖的作用，从而可以减轻化疗药物对S期DNA的合成的影响，提高骨髓细胞分裂增殖水平。艾灸组作用虽然早于针刺组1天，但整体比较针刺与艾灸无显著性差异。 5.CTX可以使大部分的细胞阻滞在G2期。针刺和艾灸可以利用细胞被阻滞的时机，尽快修复受损细胞DNA，促进骨髓细胞DNA在G2期得到修复和通过G2/M期检测点，进入M期进行细胞分裂，具有促进骨髓细胞的修复和分裂增殖的作用，艾灸优于针刺，但无显著性差异． 6.针刺和艾灸可以上调CTX小鼠骨髓细胞周期素(Cyclin D1)的表达，加速CTX小鼠细胞周期的进程，尤其是G1/S的转换，提高细胞增殖水平，进而减轻化疗导致的骨髓抑制，增加骨髓细胞数量．第5天后各组Cyclin D1表达逐渐下降，符合周期性波动之规律[13]．针刺组升高时程早于艾灸组1天且优于艾灸，第5-7天有显著差异．

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

实验一针灸对CTX小鼠外周血白细胞动态变化的影响

引言

材料与方法

1实验材料

2实验方法

3统计分析

结果

1造模后CTX小鼠外周血白细胞计数动态变化

2针灸对CTX小鼠外周血白细胞计数动态变化的影响

讨论

实验二针灸对CTX小鼠骨髓细胞DNA含量、细胞周期的动态影响

引言

材料与方法

1实验材料

2实验方法

3统计分析

结果

1针灸对CTX小鼠骨髓细胞DNA含量动态变化的影响

2针灸对CTX小鼠骨髓细胞细胞周期动态变化的影响

讨论

实验三针灸对CTX小鼠骨髓细胞细胞周期调节因子及DNA修复蛋白表达动态变化的影响

引言

材料与方法

1实验材料

2实验方法

3统计分析

结果

1小鼠骨髓细胞免疫组化染色相关蛋白的阳性表达

2针灸对CTX小鼠骨髓细胞周期调节蛋白Cyclin D1表达（%）的动态影响

3针灸对CTX小鼠骨髓细胞DNA修复蛋白表达的动态影响

讨论

总体讨论

1.中医学对骨髓抑制(白细胞减少症)及治疗的认识

2.现代医学对骨髓抑制及骨髓细胞损伤修复主要环节的认识

2.1细胞DNA损伤修复与细胞周期调控

2.2细胞DNA损伤修复与相关修复蛋白

3研究结论

4本项目的学术价值或社会、经济效益

5本项目的特色与创新之处

6存在问题与展望

参考文献

附录：实验结果图

1.流式细胞术测定小鼠骨髓细胞DNA含量及细胞周期图

2.小鼠骨髓细胞免疫组化染色相关蛋白阳性表达的变化

2.1小鼠骨髓细胞免疫组化染色Cyclin D1蛋白阳性表达图

2.2小鼠骨髓细胞免疫组化染色MGMT蛋白阳性表达图

2.3小鼠骨髓细胞免疫组化染色POL β蛋白阳性表达图

2.4小鼠骨髓细胞免疫组化染色XPD蛋白阳性表达图

致谢

文献综述

综述一针灸治疗白细胞减少症的临床和实验研究

综述二环磷酰胺所致骨髓抑制动物模型的研究

综述三细胞周期与细胞修复、增殖的研究

综述四细胞DNA损伤修复与相关修复蛋白的研究

本人在校期间的学术成绩