HPLC-MS/MS检测牛乳中类固醇激素及乳的安全性分析

摘要

目前中国乳业及乳制品加工业的产品质量正面临着重大的挑战。根据流行病学研究判断，公众对于牛奶中的类固醇激素产生越来越多的关注，乳制品与乳腺、子宫癌、卵巢癌、男性生殖障碍及青少年肥胖等疾病的发生有密切关系。类固醇激素被认为是导致这些不利健康影响的可能原因。由于分析方法和样品制备方法的不同，很难得到甾体激素的准确度结果，并且研究中的样本数和牛的生理因素也可以影响整个牛奶样品中类固醇激素含量的重要因素。因此建立行之有效的控制和检测技术，对于乳制品质量安全事件的屡屡发生具有深远意义。本实验建立高效液相色谱-串联质谱法测定牛初乳及常乳中多种类固醇激素的检测方法。
　　文章建立了高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定牛初乳及常乳中22种类固醇激素的检测方法。样品依次经过甲醇提取、HLB固相萃取小柱净化和浓缩后，再经液相色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（2.1×150mm，5μm）分离。在液相色谱-质谱（LC-MS）分析过程中以保留时间及目标物质的离子对（母离子和两个子离子）信息进行比较，以母离子和响应值高的子离子进行定量分析。该方法的最低检出限（S/N≥3）为0.10~1.20μg/kg。添加水平为100μg/kg和200μg/kg时，22种类固醇激素的平均加标回收率为82.6~95.3％，方法的变异系数（CV）为4.2~11.3%且均处于可接受范围内（CV<15%）。各激素的线性范围广（2.5~500μg/L），均有良好的线性关系，R值处于0.9943和0.9998之间。本方法具有简单、准确、快速、灵敏度高等优点，能满足实际样品检测需求。
　　用已建立好的检测方法对四川新希望示范牧场的样品进行了检测，本研究在四川新希望乳牛养殖示范牧场内随机选取10头健康的怀孕荷斯坦乳牛，收集10头荷斯坦乳牛产后分泌的1~7d的乳汁，并随机选取无抗生素使用且处在不同泌乳时期（15~320d）的荷斯坦奶牛各30头，采用HPLC-MS/MS方法分析牛初乳和常乳中类固醇激素组分及含量，结果表明，常乳中所含有的激素含量甚少，全部样品中只有部分样品检测到了3种类固醇激素，而牛初乳样品中检测到8种类固醇激素，其中初乳所含激素显著高于常乳中所含有的量（P<0.05）。
　　对乳中类固醇激素的安全性进行研究，分析了其可能存在的潜在危害，为以后进一步的研究确证提供参考。

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第1章 绪 论

1.1 本课题的研究背景目的及意义

1.2 类固醇激素

1.3 食品中激素残留潜在危害

1.4 乳中激素研究进展

1.5 激素检测方法的研究现状

1.6 本课题主要研究内容

第2章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验主要仪器与试剂

2.3 HPLC-MS/MS检测类固醇激素方法的建立

2.4 采用建立的方法对实际样品进行分析

2.5 数据统计分析

第3章 HPLC-MS/MS测定类固醇激素的方法研究

3.1 引言

3.2 类固醇类激素检测的色谱条件优化

3.3质谱条件的优化

3.4样品前处理的优化

3.5 HPLC-MS/MS测定乳中类固醇激素的方法学研究

3.6 本章小结

第4章 乳中类固醇激素的检测及潜在安全性分析

4.1 引言

4.2 牛初乳中类固醇激素

4.3 常乳中类固醇激素

4.4 乳中激素的潜在安全性分析

4.5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文及其他成果

声明

致谢