基因治疗剂pUDKH的分析与质量控制

摘要

质粒DNA作为基因治疗剂受到研究者的重视和深入的研究.质粒DNA作为基因载体比较安全、使用方便,但质粒DNA在靶细胞中的基因表达效率低、持续时间短.pUDKH是自行构建的携带HGF的重组质粒,能够促进血管生成.实验目的:对基因治疗剂质粒pUDKH的质量进行分析及质量控制.实验方法:采用阴离子交换色谱法监测质粒生产过程和质粒产品中超螺旋pUDKH的比例,所用的色谱条件为:色谱柱Tsk-gel DNA-NPR[0.46cm(id)×7.5cm(1)];流动相20mmol/L Tris-HCl,1mol/LNaCl pH8.8梯度洗脱.质粒pUDKH生产过程中需加入去污剂(Triton X-100)溶液,随后需除去这些物质,并检测其在最终产品中的残留含量.方法用反相液相色谱测定质粒产品的Triton X-100含量,色谱系统包括C<,18>色谱柱HYPERSIL ODS2(250×4.6mm),洗脱溶剂为乙腈:水=70:30(V/V),流速:1.0ml/min,进样量10μl,检测波长223nm.结果回收率为100.19±4.23,日内精密度为4.36﹪,日间精密度为4.17﹪,Triton X-100在1.25~20 μg/ml浓度范围内呈线性关系.结论Triton X-100的检测最低限可达1.25 μg/ml,有良好的准确度与精密度,样品不需预处理,不受其它成分的干扰.pUDKH产品中的Triton X-100含量在2.27~3.00 μg/ml之间.ELISA(酶联免疫)法测样品中宿主蛋白质含量,对96孔板中的样品用酶联仪Elx-800测其570nm的吸收值,OD值对蛋白浓度作图,据标准曲线计算样品中残留蛋白含量;Northern分子杂交半定量法测定残留宿主DNA含量;同时采用鲎试剂法测定内毒素含量.结果表明:质粒中超螺旋pUDKH含量达95﹪(质量百分比)以上,残留核糖核酸RNA检测不到,宿主蛋白含量小于10mg/mg质粒DNA,残留宿主DNA含量小于2ng/mg质粒DNA,内毒素含量约0.00178EU/mg.

目录

文摘

英文文摘

哈尔滨工程大学学位论文原创性声明

第1章绪论

1.1本文研究背景、目的及意义

1.2质粒DNA的生产工艺

1.2.1发酵

1.2.2细胞裂解

1.2.3回收与净化

1.2.4纯化和精制

1.3工作基础

1.3.1构建携带人肝细胞生长因子基因的重组载体pUDKH

1.3.2质粒的制备

1.4质量控制考虑

第2章质粒pUDKH浓度及纯度的分析

2.1吸光度法

2.1.1仪器与试剂

2.1.2实验步骤

2.1.3结果与讨论

2.2电泳法

2.2.1仪器与试剂

2.2.2实验步骤

2.2.3结果与讨论

2.3本章小结

第3章离子交换色谱分析质粒pUDKH

3.1液相色谱的种类

3.1.1正相液相色谱

3.1.2反相液相色谱

3.1.3离子对液相色谱

3.1.4凝胶色谱

3.2离子交换色谱

3.2.1原理与特点

3.2.2离子交换剂填料

3.2.3离子交换色谱流动相

3.3实验仪器和方法

3.3.1仪器与试剂

3.3.2色谱条件

3.4结果与讨论

3.4.1成分鉴定

3.4.2质粒pUDKH生产过程的监测

3.4.3最终质粒pUDKH产品分析

3.5本章小节

第4章puDKH稳定性试验

4.1稳定性观察

4.1.1配方

4.1.2温度

4.1.3光照

4.2仪器与方法

4.3实验步骤

4.3.1温度及pH影响实验

4.3.2 pUDKH光照条件下稳定性观察

4.4结果与讨论

4.4.1pUDKH不同温度及pH值条件下超螺旋型式比例

4.4.2未光照样品与光照样品进行比较(HPLC分析)

4.4.3电泳图分析

4.5本章小节

第5章反相液相色谱法定量分析质粒pUDKH样品中Triton X-100

5.1试剂与方法

5.1.1仪器与试剂

5.1.2色谱条件

5.1.3 Triton X-100标准液的配制

5.2实验结果

5.2.1标准曲线、线性范围及最小检测量

5.2.2精密度试验

5.2.3回收率试验

5.2.4 pUDKH产品中Triton X-100含量分析

5.3本章小节

第6章细菌内毒素试验

6.1实验仪器和试剂

6.1.1仪器

6.1.2试剂

6.2实验步骤

6.2.1样品内毒素检查

6.2.2鲎试剂灵敏度复核

6.2.3结果与讨论

6.3本章小结

第7章细菌基因组DNA测定

7.1实验方法与试剂

7.1.1CA-菌DNA提取(试剂盒)

7.1.2配置试剂

7.2实验步骤

7.2.1制备阳性对照

7.2.2点膜

7.2.3制备探针

7.2.4预杂交

7.2.5杂交

7.2.6显色

7.3结果与讨论

7.4本章小结

第8章菌体蛋白含量测定

8.1 BCA法测蛋白质含量

8.1.1材料与方法

8.1.2标准溶液的配制

8.1.3工作液(Standard Working Reagent)S-WR配制

8.1.4实验步骤

8.1.5结果与讨论

8.2 ELISA法测蛋白含量

8.2.1试剂与仪器

8.2.2实验步骤

8.2.3结果与讨论

8.3本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

附图