原生质体诱变及抗性选育L-组氨酸产生菌

摘要

本文以谷氨酸棒杆菌S9114(Corynebacterium glutamicum S9114)为出发菌株，根据发酵代谢调控理论进行诱变选育L-组氨酸产生菌。主要研究内容和结果如下： ①确立了定量分析发酵液中L-组氨酸的“Paully标准加入法”。以经硫酸锌预处理(以锌离子屏蔽L广组氨酸咪唑基的PauUy反应)的谷氨酸棒杆菌S914发酵液为空白，以Paullv法绘制标准加入曲线，其线性回归方程：y=12.036x+0.0075，相关系数：R2=0.9989。该法可减小发酵液中钙离子、镁离子、氨离子等对Paully法的干扰，且保持了Paullv法定量分析L-组氨酸简单、快速的优点； ②以浊度法测定菌悬液浓度。结合平板菌落计数，以生理盐水为空白，在620nm波长绘制菌悬液浓度标准曲线，其线性回归方程：y=0.3448x一0.0043，相关系数R2=0.9992；同时确定了前培养周期为12h、种子培养周期为12h； ③以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株，经亚硝酸钠诱变、6-巯基嘌呤平板初筛，选育出一株L-组氨酸产生菌Y1，该菌株可积累L组氨酸248mg/L；谷氨酸棒杆菌S9114经紫外线与氯化锂复合诱变、6.巯基嘌呤平板初筛，选育出一株L-组氨酸产生菌LF11，该菌株可积累L-组氨酸257mg/L； ④以含2％甘氨酸的液体完全培养基将谷氨酸棒杆菌LFll预培养至对数生长期、6.7U/mL青霉素钠预处理2h、2000U/ml，蛋清溶菌酶处理12h，原生质体制备率为98.90％：以含0.5mol/L蔗糖的等渗完全培养基平板再生，再生率为10.67％； ⑤根据浅盘发酵的原理自行设计出双层平皿初筛。与摇瓶发酵复筛相比，前者耗时少、培养基用量少；经对比，突变株L广组氨酸积累能力排序的平皿初筛与摇瓶复筛结果相吻合，且在平皿初筛中也未见染菌现象； ⑥原生质体的制备和再生有诱变效应。以谷氨酸棒杆菌LFll为出发菌株，经再生诱变，筛选低浓度6-巯基嘌呤、D-组氨酸、4-硫尿嘧啶抗性突变株，得到菌株LYl，该菌株可积累L组氨酸265mg/L： ⑦以谷氨酸棒杆菌LFll为出发菌株制备原生质体并进行多次诱变，逐级引入并筛选高浓度6-巯基嘌呤(MP)、D-组氨酸(DH)、4.硫尿嘧啶(4-AU)和1,2,4.三噻唑-3-丙氨酸(TRA)抗性突变株，最终选育出一株L-组氨酸产生菌UN26221(Mpr+DHr+4-Aur+TRAr),该菌株在未经发酵条件优化时可积累L-组氨酸2093mg/L

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章引言

1.1组氨酸的理化性质

1.2 L-组氨酸的生理功能及应用

1.2.1抗氧化

1.2.2临床应用

1.2.3饲料添加剂

1.2.4 L-组氨酸衍生物的应用

1.3生产方法

1.3.1化学合成法

1.3.2蛋白质水解法

1.3.3发酵法

1.4国内外研究概况

1.5本研究育种思路

1.5.1氨基酸代谢途径分析

1.5.2L-组氨酸代谢网络分析

1.5.3出发菌株的选择

1.5.4育种手段的选择

1.6立题背景

1.7研究内容

第2章L-组氨酸产生菌株的诱变选育

2.1材料

2.1.1菌种

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器

2.2方法

2.2.1前培养

2.2.2紫外线诱变

2.2.3亚硝酸钠诱变

2.2.4氯化锂诱变

2.2.5紫外线与亚硝酸钠复合诱变

2.2.6紫外线与氯化锂复合诱变

2.2.7后培养

2.2.8 6-巯基嘌呤平板初筛

2.2.9搖瓶发酵复筛

2.3结果与分析

2.3.1紫外线诱变致死曲线

2.3.2亚硝酸钠诱变致死曲线

2.3.3氯化锂诱变致死曲线

2.3.4 6-巯基嘌呤抗性菌株筛选结果

2.3.5发酵复筛结果

2.4结论

2.5讨论

第3章谷氨酸棒杆菌原生质体的制备及再生

3.1材料

3.1.1菌种

3.1.2培养基

3.1.3主要试剂

3.2方法

3.2.1谷氨酸棒杆菌的活化

3.2.2菌悬液浓度-OD620标准曲线的制作

3.2.3前培养生长测定

3.2.4种子培养生长测定

3.2.5原生质体的制备及再生

3.3结果与分析

3.3.1菌悬液浓度-OD620标准曲线

3.3.2前培养生长曲线

3.3.3种子培养生长曲线

3.3.4谷氨酸棒杆菌原生质体的制备及再生结果

3.4结论

第4章原生质体诱变选育L-组氨酸产生菌

4.1材料

4.1.1菌种

4.1.2培养基

4.1.3主要试剂

4.2方法

4.2.1原生质体单因素诱变

4.2.2原生质体复合诱变

4.2.3复合抗性菌株初筛

4.2.4平皿初筛

4.2.5摇瓶复筛

4.2.6遗传稳定性试验

4.3结果与分析

4.3.1原生质体单因素诱变致死曲线

4.3.2 L-组氨酸产生菌株筛选结果

4.3.3遗传稳定性试验结果

4.4结论

第5章发酵液中L-组氨酸的定量分析

5.1材料

5.1.1发酵液

5.1.2主要试剂

5.2方法

5.2.1 L-组氨酸标准曲线的制作

5.2.2硫酸锌去L-组氨酸试验

5.2.3用标准加入法制作L-组氨酸标准曲线

5.3结果与分析

5.3.1 L-组氨酸标准曲线

5.3.2硫酸锌对Paully法的影响

5.3.3标准加入法的L-组氨酸标准曲线

5.4结论

第6章总结与展望

6.1研究内容

6.2全文总结

6.2.1由谷氨酸棒杆菌S9114诱变选育L-组氨酸产生菌

6.2.2谷氨酸棒杆菌原生质体的制备及再生

6.2.3由谷氨酸棒杆菌LF11原生质体诱变选育L-组氨酸产生菌

6.2.4应用“Paully-标准加入法”定量分析发酵液中的L-组氨酸

6.3本论文创新点

6.4展望

参考文献

致谢

附录