代谢工程改造解脂耶氏酵母产巴豆酸

摘要

巴豆酸是一种含有四个碳原子并且含有双键的有机羧酸，由于其分子内具有碳碳双键的结构，使其化学性质较为活泼。巴豆酸主要在医药，化工等领域具有十分重要的应用。目前巴豆酸的生产主要依赖化学合成法合成，以石油裂解所产生的乙烯为原料之一，再经由一系列化学反应最终由巴豆醛转变为巴豆酸。随着国际能源危机的加重以及环境的恶化，显然对于依赖化石燃料为基础的工业从成本以及可持续发展的方面考虑，该产业都会受到一定程度的影响。所以人类不得不通过其他方式来实现辅助或替代该产业。 随着基因工程学手段的发展，人类逐渐成功地从微生物中获取一系列的物质，首当其冲的模式生物也是人类目前为止研究最为透彻的微生物就是原核生物的代表大肠杆菌。虽然目前大多数的研究都是在该微生物中展开研究的，但是大肠杆菌因其具有一定的致病性，且原核表达系统的自身的一些生物特性限制了其在工业生产中大规模应用。随之诞生的酵母体系被认为是工业化生产中较为理想的表达体系模式生物，真核生物相较于原核生物，因其自身表达系统的完整性使得真核生物表达体系在工业化发酵产业上比大肠杆菌的表达体系更具优势。 解脂耶氏酵母作为一种新型的酵母表达体系越来越被广泛接受，因其较高的安全性（GRAS），使得该酵母代谢产生的产物被广泛应用于食品，医药等领域。同时解脂耶氏酵母自身具有脂肪酸代谢途径，对低pH值等极端环境的耐受能力更强。综上，以解脂耶氏酵母为载体，是当前微生物发酵研究的主流方向之一。 本研究，在设计巴豆酸代谢途径之初，在丙酮丁醇梭菌体内发现其自身代谢产丁醇的路径中具有合成巴豆醛的相关的路径和关键酶，并以此为基础继续挖掘，最终成功在解脂耶氏酵母中构建了合成巴豆酸的合成路径。通过气相质谱测定，培养基中含有巴豆酸。随后通过高效液相色谱测定，巴豆酸的产量为62.24mg/L。随后，对构建的路径进行进一步的优化，通过过表达路径中的关键酶，目的是实现过量积累巴豆酸前体物质以达到巴豆酸的高产，经过液相测定产量达到123.49mg/L，产量提高近一倍之多。随后继续对路径进行优化，将丙酮酸到乙酰辅酶A实现一步合成，降低了原本需要是三步才能合成的每步的代谢消耗，使得更多的前体物质流向合成巴豆酸的下游，最终经过液相测定巴豆酸的产量提高到了220.00mg/L，总体产量提升了2倍之多。 相较于化学法合成方式，本研究实现了在生物体内将糖类转化为巴豆酸的过程，对底物和生产条件要求相对较低，产物对环境没有很强烈的危害；相较于大肠杆菌的生产模式来说，本研究中所使用的菌种，适合高密度培养，且对低pH环境耐受性相对较高，符合工业化生产的要求。

目录

声明

第1章 引 言

1.1 概述

1.1.1巴豆酸

1.1.2 巴豆酸的制备及发展

1.1.3 巴豆酸的用途

1.1.4 微生物代谢巴豆酸的代谢途径

1.1.5 酵母菌的研究进展

1.1.6 丙酮丁醇梭菌产丁醇途径

1.2 本课题研究的意义及主要内容

1.2.1 研究意义

1.2.2 主要内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要试剂及培养基的配制方法

2.2实验方法

2.2.1 感受态大肠杆菌的制备

2.2.2 大肠杆菌感受态的转化

2.2.3 酵母细胞感受态的制备

2.2.4 感受态酵母细胞的转化

2.2.5 发酵产物的提取

2.2.6 基因表达载体的构建

2.2.7 质粒提取

2.2.8 切胶回收

2.2.9 气相质谱测定产物

2.2.10 液相色谱测定产物含量

2.2.11 生长曲线

第三章 改造解脂耶氏酵母产巴豆酸

3.1 引言

3.2 材料及方法

3.2.1 试剂与酶

3.2.2 实验器材

3.2.3 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.4 实验小结

第四章 优化代谢路径以提高巴豆酸的产量

4.1引言

4.2 材料与方法

4.2.1 试剂与酶

4.2.2 实验器材

4.2.3 实验方法

4.3 实验结果与讨论

4.4 实验小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

致谢

研究生期间发表的论文