解脂耶罗维亚酵母产神经酸代谢工程研究

摘要

神经酸(nervonic acid)是大脑神经细胞和组织中的一种天然成分，也是世界公认的具有修复疏通受损大脑神经通路、恢复神经末梢活性、促进神经细胞生长和发育功能的重要物质。为此，神经酸已然成为预防和治疗大脑相关疾病的最佳选择。
　　自然界中神经酸来源稀少，远远不能满足市场对其的需求。本文通过基因工程技术对解脂耶罗维亚酵母（yarrowia lipolytica）代谢途径进行改造，获得了产神经酸的解脂耶罗维亚酵母工程菌株。具体研究结果如下:
　　(1)通过同源重组技术敲除URA3基因，获得了解脂耶罗维亚酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株URA3-po1g。
　　(2)采用Gibson Assembly方法，对解脂耶罗维亚酵母内源基因SCD(stearoyl-CoA desaturase)和DGA1(diacylgycerol acyltransferase1)，外源基因AtFAE1（fatty acid elongase1from Arabidopsis thaliana）、BtFAE1(fatty acid elongase1from Brassica tournefortii、MaKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Microalgae)、MoKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Malania oleifera)和CgKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Cardamine graea)进行了表达质粒构建，获得了以下重组表达质粒:pMT-DGA1-SCD_HGR、pMT-BtFAE1-AtFAE1_LEU、pMT-MaKCS_URA、pMT-MoKCS_URA和pMT-CgKCS_URA。
　　(3)采用醋酸锂转化法，将重组表达质粒pMT-DGA1-SCD_HGR、pMT-BtFAE1-AtFAE1_EU成功导入URA3-po1g酵母，获得了重组菌株URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1)，在此基础上，分别导入重组表达质粒pMT-MaKCS_URA、pMT-MoKCS_URA和pMT-CgKCS_URA，成功获得了重组菌株URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-MaKCS)、URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-MoKCS)和URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS)。
　　(4)通过摇瓶发酵培养，分别采用氯仿-甲醇法和硫酸-甲醇法提取油脂和脂肪酸甲脂化，将得到的脂肪酸甲酯通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，筛选到产神经酸的解脂耶罗维亚酵母工程菌株URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS)，其中URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS)7号单克隆神经酸含量最高，占其油脂的1.5％，并且其油脂占细胞干重的比重是对照菌株URA3-Po1g的3倍。
　　(5)建立了一套完整有效的解脂耶罗维亚酵母的分子生物学研究机制，为之后进行解脂耶罗维亚酵母产神经酸的产业化提供了理论和实验依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 神经酸的概述

1．1．1 神经酸的化学结构

1．1．2 神经酸的生物学活性

1．1．3 神经酸在预防和治疗脑病中的应用

1．2 自然界中神经酸的来源

1．2．1 动物来源

1．2．2 植物来源

1．2．3 微生物来源

1．3 神经酸的合成

1．3．1 神经酸的化学合成

1．3．2 神经酸的生物合成

1．4 KCS基因

1．4．1 KCS的分类

1．4．2 KCS的底物特异性

1．5 解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)

1．5．1 解脂耶罗维亚酵母的简介

1．5．3 甘油二酯酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGA1)

1．6 本文立题依据和设计思路

1．6．1 研究背景和立题依据

1．6．2 研究方案

1．6．3 技术路线

1．6．4 研究目标

第二章 解脂耶罗维亚酵母URA3基因敲除菌株的构建

2．1 实验材料

2．2 实验仪器

2．3 实验步骤和方法

2．3．1 引物设计

2．3．2 聚合酶链式反应(PCR)

2．3．4 重组质粒pUC-URA3YL的构建

2．3．7 重组质粒puC-URA3YL的酶切鉴定

2．3．8 菌种的保藏与测序

2．3．9 重组质粒转化酵母

2．3．10 敲除掉URA3基因的解脂耶罗维亚酵母Po1g(URA3-po1g)的初步验证

2．3．12 URA3-po1g的PCR鉴定和保藏

2．4 结果与分析

2．4．2 重组质粒pUC-URA3YL的线性化和Po1g(URA3-po1g)的初步验证

2．4．3 URA3-po1g基因组DNA的提取和PCR鉴定

2．5 本章小结

第三章 多基因表达载体的构建

3．1 实验材料

3．2 实验仪器

3．3 实验步骤和方法

3．3．1 引物设计

3．3．2 聚合酶链式反应(PCR)

3．3．3 PCR产物的琼脂糖凝胶纯化

3．3．4 重组质粒的构建

3．3．5 重组质粒的转化

3．3．6 菌落PCR(colony PCR)扩增

3．3．7 重组质粒的快速提取

3．3．8 重组质粒的酶切鉴定

3．3．9 菌种的保藏与测序

3．4 结果与分析

3．4．1 目标片段的PCR扩增

3．4．2 Colony PCR扩增

3．4．3 重组质粒的酶切验证

3．4．4 重组质粒的序列测定

3．5 本章小结

第四章 多基因表达质粒转化URA3-po1g

4．1 实验材料

4．2 实验仪器

4．3 实验步骤和方法

4．3．1 重组质粒的快速提取

4．3．2 重组质粒的线性化

4．3．3 重组质粒转化酵母

4．3．5 导人重组质粒的URA3-po1g的保藏

4．3．9 气相色谱分析脂肪酸成分

4．4 结果与分析

4．4．1 重组质粒线性化

4．4．2 Colony PCR扩增

4．4．3 导人重组质粒的URA3-po1g重组菌株

4．4．4 脂肪酸提取

4．4．5 气相色谱(GC)和气相-质谱(GC-MS)的结果与分析

4．4．6 不同基因对URA3-po1g脂肪酸成分的影响

4．4．7 不同重组菌株脂肪酸成分的对比分析

4．5 本章小结

5．1 研究结果

5．2 存在的问题

5．3 本文的创新点

参考文献

附录

缩略词

致谢

作者简介