BLI技术筛选高亲和力单克隆抗体在胶体金免疫层析试纸中的应用

摘要

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila，Lp）是能感染人的重要呼吸道病原菌。目前针对该病原菌的传统检测方法存在检测操作周期耗时长，结果滞后，操作专业性强，不能进行床旁诊断等问题，在实际应用中受到很大的限制。本研究通过生物膜干涉技术（BLI）快速且准确地筛选一对高效分泌抗病原菌表面蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并以该单克隆抗体为基础，成功建立了一种基于胶体金免疫层析的快速、灵敏、准确的检测嗜肺军团菌抗原的方法。 本研究首先对Lp表面特有蛋白PAL的基因克隆及表达纯化，纯化后的蛋白多次免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠，化学方法进行细胞融合，利用BLI技术和间接ELISA这两种方法对杂交瘤细胞上清进行筛选与亚克隆，通过斑点杂交实验验证抗体的有效性后，制备腹水并通过硫酸铵沉淀及Protein A亲和层析纯化得到2株单克隆抗体。通过间接ELISA、Western blot和BLI等检测技术对纯化后的单克隆抗体进行特异性及结合力分析。 斑点杂交实验结果表明，BLI技术筛选出的3种抗体均有阳性反应，而间接ELISA筛选出的11种抗体中只有3种有阳性反应，说明BLI筛选方法比间接ELISA更准确且有说服性；选取经BLI技术筛选得到的2株细胞（1G10B2G1和1G10B2F5）制备单克隆抗体（Lp-7和Lp-26）；间接ELISA检测抗体效价均达到1：409600以上；利用BLI技术平台中的随机法和典型夹心法验证了配对的抗体识别的是同一抗原的不同抗原表位，即抗体间无竞争效应，也没有空间结合位阻效应；根据BLI技术的筛选结果，优先选择结合率快的抗体作为捕获抗体，在胶体金免疫层析试纸平台上进行检测，其中，抗体Lp-26作为对应试纸条的捕获抗体，抗体Lp-7作为对应试纸条的金标抗体，制作的试纸最低检出限均为1×107CFU/mL；其与肺炎链球菌、卡他莫拉菌等其他10种常见呼吸道病原菌均无交叉反应。 BLI技术较传统的ELISA检测方法有利于提高杂交瘤细胞上清筛选的精确度，减少筛选的工作量，便于快速筛选出结合力强的抗体以用于胶体金免疫层析检测试纸的制备，有利于病原菌感染的快速检测。

目录

声明

第1章 前 言

1.1 嗜肺军团菌简介

1.1.1 生物学特性

1.1.2 流行病学

1.1.3 致病性及其耐药性

1.2 病原菌现有检测诊断方法

1.3 嗜肺军团菌表面蛋白PAL

1.4 单克隆抗体制备、筛选及鉴定

1.4.1 单克隆抗体制备基本原理

1.4.2 单克隆抗体筛选方法

1.4.3 胶体金免疫层析试纸鉴定单克隆抗体

1.5 研究内容

第2章 嗜肺军团菌PAL蛋白的基因克隆及表达纯化

2.1 实验材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 主要试剂材料

2.1.3 主要溶液

2.1.4 仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 Lp的pal基因克隆

2.2.2 Lp-PAL蛋白表达及纯化

2.2.3 重组蛋白的Ni柱纯化

2.3 实验结果

2.3.1 Lp的pal基因克隆结果

2.3.2 Lp-PAL蛋白表达及纯化结果

2.4 本章小结

第3章 Lp-PAL融合蛋白单克隆抗体的筛选

3.1 实验材料

3.1.1 抗原及实验小鼠的来源

3.1.2 主要试剂耗材

3.1.3 仪器与设备

3.2 实验方法

3.2.1 动物免疫及效价检测

3.2.2 细胞融合

3.2.3 杂交瘤细胞上清筛选

3.3 实验结果

3.3.1 动物免疫效价测定结果

3.3.2 细胞融合筛选结果

3.3.3 嗜肺军团菌Lp亚克隆筛选结果

3.4 本章小结

第4章 单克隆抗体的纯化及其鉴定

4.1 实验材料

4.1.1 抗原、细胞株及实验小鼠的来源

4.1.2 主要耗材

4.1.2 主要试剂

4.1.3 仪器与设备

4.2 实验方法

4.2.1 单克隆抗体的大量制备（腹水制备）

4.2.2 腹水验证（斑点试验）

4.2.3 单克隆抗体的纯化及其滴度检测

4.2.4 Mouse单克隆抗体亚型鉴定

4.2.5蛋白质免疫印迹（Western blot）鉴定其特异性

4.2.6 BLI鉴定抗原抗体特异性

4.2.7 胶体金层析试纸鉴定抗原抗体特异性

4.3 实验结果

4.3.1 腹水制备结果

4.3.2 腹水验证

4.3.3 单克隆抗体纯化及其滴度检测

4.3.4 Mouse单克隆抗体亚型鉴定

4.3.5 Western blot鉴定其特异性结果

4.3.6 BLI鉴定其特异性结果

4.3.7 胶体金层析试纸鉴定抗原抗体特异性

4.4 本章小结

第5章 总结与展望

5.1 研究结论

5.2 创新之处

5.3 研究展望

参考文献

致谢

附录

缩略语表