嵌套式PCR超灵敏检测马铃薯环腐病菌

摘要

该研究先是应用国外成功报道的根据存在于pCSI质粒和环腐菌染色体中一个1.3kb的插入因子IS1121、高度重复的DNA片段设计的环腐病菌亚种特异引物序列合成出引物对CMSIF-1-CMSIR1和引物对CMSIF2-CMSIR2.由于引物对CMSIF1-CMSIR1和引物对CMSIF2-CMSIR2序列中的G、C的含量较高,在反应体系中适当加入甲酰胺,比较实验结果甲酰胺可大大降低错配率,提高了特异性片段的产量.分别以环腐菌基因组DNA和菌悬液为模板进行直接PCR,结果表明以菌悬液为模板仍可同样得到特异性片段(直接PCR以引物对CMSIF1-CMSIR1扩增出1046bp的片段,这个结果大大简化了提取细菌基因组DNA的步骤.分别以环腐菌菌悬液和直接PCR产物为模板应用嵌套式PCR中的引物对CMSIF2-CMSIR2进行扩增,结果表明只有经过直接PCR扩增嵌套式PCR扩增才有特异性产物产生.以环腐标准菌株、黑龙江省环腐菌株以及马铃薯上其它主要的细菌病原菌(青枯病、软腐病、黑胫病)为实验材料进行直接PCR和嵌套式PCR扩增,结果只有环腐标准菌株和黑龙江省环腐菌株出现特异性片段(直接PCR扩增出1046bp的片段,嵌套式PCR扩增出864bp的片段).将环腐菌纯菌种菌悬液稀释成浓度梯度并与马铃薯组织液混合进行直接PCR和嵌套式PCR检测灵敏度比较,结果表明嵌套式PCR检测灵敏度比直接PCR检测灵敏度提高了100-1000倍,同时与间接ELISA方法检测灵敏度进行了比较.以明显病症状的块茎、无明显感病症状的块茎和健康块茎为实验材料进行直接PCR和嵌套式PCR,结果为所有无明显感病症状的块茎均被检测出带有环腐病菌.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1研究的目的及意义

1.2文献综述

1.2.1马铃薯环腐病

1.2.3血清学方法鉴定检测马铃薯环腐病菌

1.2.4分子生物学方法检测马铃薯环腐病菌

1.2.5立体依据

2材料和方法

2.1供试菌株

2.2马铃薯主要细菌病病原菌培养基筛选

2.3引物合成

2.4嵌套式PCR基本方法的研究

2.4.1基因组DNA提取

2.4.2 PCR反应条件

2.4.3以引物对CMSIF2-CMSIR2进行直接PCR扩增

2.5侵染马铃薯的不同病原细菌菌株PCR扩增

2.5.1样品准备

2.5.2 PCR反应

2.5.3 PCR产物分析

2.6嵌套式PCR检测灵敏度测定

2.6.1样品准备

2.6.2纯菌种悬浮液进化PCR反应

2.6.3菌悬液与马铃薯组织液混合进行PCR

2.7间接ELISA法检测灵敏度测定

2.7.1环腐菌抗血清制备及IgG纯化

2.7.2间接ELISA检测环腐菌

2.8马铃薯组织中环腐病菌的检测

2.8.1 DNA提取方法

2.8.2样品制备

2.8.3 PCR反应

2.8.4 PCR产物分析

3结果分析

3.1马铃薯主要病原细菌培养基筛选

3.2嵌套式PCR基本方法的研究

3.3侵染马铃薯的不同病原细菌菌株PCR扩增

3.4嵌套式PCR检测灵敏度测定

3.4.1纯菌种悬浮液进行PCR反应

3.4.2菌悬液与马铃薯组织液混合进行PCR

3.5间接ELISA法检测灵敏度测定

3.6马铃薯组织中环腐病菌的检测

4讨论

4.1传统方法鉴定马铃薯环腐病菌

4.2血清学方法检测环腐病菌

4.3分子检测马铃薯环腐菌

5结论

参考文献

致谢

个人简历